Uzyskiwanie roślin haploidalnych (n). PDF

Preview

Summary

Metody kultur in vitro 12. Uzyskiwanie haploidalnych (n). 1. Metody otrzymywania haploidalnych. haploidalnych w hodowli rolnej sprowadza do faktu, zwykle tylko 1 allel danego genu przez co zawsze cechy recesywne oraz mutacje w a z genami letalnymi co powoduje ich z puli genetycznej. homozygotyczne d...

Description

Metody kultur in vitro Wykład 12. Uzyskiwanie roślin haploidalnych (n). 1. Metody otrzymywania roślin haploidalnych. Wartość roślin haploidalnych w hodowli rolnej sprowadza się do faktu, że posiadają zwykle tylko 1 allel danego genu przez co zawsze cechy recesywne oraz mutacje ujawniają się w pełni, a rośliny z genami letalnymi giną, co powoduje ich eliminację z puli genetycznej. Mogą dawać homozygotyczne diploidy lub poliploidy, które często mają większą wartość w hodowli (pszenica, ryż), a przez zastąpienie techniki krzyżowania wsobnego metoda ta pozwala na skrócenie czasu otrzymywania hybryd dominujących. Tworzenie roślin haploidalnych w warunkach in vitro zachodzi dzięki procesom: • androgenezy – uzyskiwanie roślin haploidalnych z kultur pylników lub izolowanych mikrospor: o dotychczas drogą kultur pylników uzyskano rośliny haploidalne u około 250 gatunków; o najczęściej stosowane u: Solanaceae, Cruciferae, Gramineae, Ranunculaceae 1 (psiankowatych, krzyżowych, traw i jaskrowatych) • gynogenezy – uzyskiwanie roślin haploidalnych z haploidalnych komórek gametofitu żeńskiego (niezapłodnionych komórek jajowych zalążni): o stosowane o wiele rzadziej przez większy poziom trudności i skomplikowania procedur; • traktowania kolchicyną (C22H25NO6) – czyli substancją zatrzymującą podział komórek na etapie metafazy; • krzyżowania blisko spokrewnionych gatunków – w której często następuje eliminacja jednego z genomów. 2. Androgeneza in vitro. Androgeneza – proces ten w naturze spontanicznie zachodzi bardzo rzadko i indukowany jest działaniem czynników fizycznych lub chemicznych (czasem obu). Podczas krzyżowań międzygatunkowych hodowli haploidalnych może nastąpić eliminacja chromosomów. Czynnikami wpływającymi na proces androgenezy są: • genotyp: o zdolność komórek pyłku do indukcji embriogenezy jest zależna od gatunku i uwarunkowana genetycznie; o u zbóż zdolność ta zależy głównie od genotypu, w przypadku niektórych innych roślin np. tytoniu zależy bardziej od warunków środowiskowych; • dodatek ścian otoczki pyłku: o nie są poznane specyficzne składniki otoczki pyłku, jednak wiadomo, że dodatek ekstraktu ze ściany komórkowej pyłku promuje androgenezę; o w niektórych przypadkach dodatek glutaminy lub glutaminy i seryny z myoinozytolem daje efekt analogiczny jak ekstrakt ścian mikrospor; • podłoże: o najczęściej stosowanym podłożem jest bardzo uboga pożywka Nitsch medium; o rodzaj wykorzystywanej pożywki ma największe znaczenie u zbóż (zwłaszcza ryżu), ponieważ najczęstszym problemem jest regeneracja roślin albinotycznych (bezzieleniowych), które należy wystawić na światło lub dodatkowo suplementować azotem; 1

nie mają znaczenia gospodarczego, ale wykorzystywane są jako rośliny modelowe w badaniach androgenezy.

hormony: o należy je ostrożnie stosować; o bez dodatku hormonów hoduje się głównie pylniki roślin z rodziny psiankowatych u których w obecności ściany komórkowej pyłku nie formuje się kalus; o z dodatkiem hormonów hoduje się pylniki roślin dwuliściennych innych niż psiankowate oraz roślin jednoliściennych u których wymagany jest dodatek auksyn i cytokinin lub złożonych mieszanin organicznych (w postaci np. mleczka kokosowego); o stosuje się również dodatki sacharozy o stężeniach wyższych niż 2%; • gęstość hodowli: o dla hodowli embrionów powinna wynosić 15 mililitrów na pylnik, natomiast dla regeneracji roślin 5,5 mililitrów na pylnik; o należy stosować suplementacje etylenem; o gęstość zawiesiny pyłku zależy od gatunku i wymagana jest unifikacja zwykle do około 3000 pyłków na mililitr podłoża; • stadium rozwojowe: o mikrospora lub pyłek musi przejść ze stadium rozwojowego gametycznego w stadium sporofityczne; o najlepszym momentem do indukcji przejścia to czas tuż przed podziałem mikrospory lub tuż po podziale mitotycznym mikrospory, czyli kiedy zaczynają formować się komórki wegetatywne i generatywne. W warunkach normalnych komórki macierzyste pyłku zlokalizowane są w woreczku pyłkowym, gdzie zachodzi ich rozwój. Pierwszym etapem jest mejoza, w wyniku której powstają komórki macierzyste pyłku (PMC, ang. pollen mother cell), a z każdej jednej formuje się tetrada. W następnym etapie mikrospory są uwalniane z tetrad i dojrzewają przekształcając się w ziarna pyłku, które przechodzą pierwszy i drugi podział mitotyczny formując się w komórki generatywne i wegetatywne. •

Rysunek 1. Etapy mikrosporogenezy (proces powstawania mikrospor) oraz mikrogametogenezy (proces powstawania gametofitu męskiego).

Ogromne znaczenie dla formowania embrionów w androgenezie ma moment zebrania komórek i wprowadzenia ich do hodowli: stadium, temperatura, stan fizjologiczny roślin matecznych, pora dnia itp. Androgeneza pyłku niektórych gatunków musi być zainicjowana specyficznymi warunkami jak np. niska temperatura: • pyłek Datura (bieluń) i Nicotiana (tytoń) wymaga szoku niskotemperaturowego: o 13°C jest temperaturą optymalną dla formowania embrionów ryżu, prosa, kukurydzy czy rosplenicy; • pyłek Brassica (kapusta) wymaga szoku wysokotemperaturowego: o 35°C jest temperaturą optymalną dla formowania embrionów kapusty czy papryki. W przypadku większości gatunków najbardziej efektywnym jest pobranie materiału z rośliny tuż przed lub tuż po pierwszym kwitnieniu. STADIUM WCZESNE JEDNOKOMÓRKOWE

STADIUM PÓŹNE JEDNOKOMÓRKOWE

STADIUM MITOTYCZNE

Długość płatka (mm)

11

14-17

17-24

Liczba wyłożonych pylników

20

39

69

Liczba zusykanych embrionów

2 (10%)

15 (38%)

31 (45%)

Liczba zregenerowanych roślin

0 (0%)

4 (10%)

4 (6%)

Tabela 1. Wpływ stadium rozwojowego pyłku na formowanie embrionów w kulturach tytoniu. RODZAJ

Nicotiana

Brassica

TEMPERATURA

% PYLNIKÓW FORMUJĄCYCH EMBRIONY

22°C

22

3-5°C

58

25°C

0,5

25°C

9

Tabela 2. Wpływ temperatury na przebieg androgenezy. RODZAJ

DNI PO PIERWSZYM KWITNIENIU

% PYLNIKÓW FORMUJĄCYCH EMBRIONY

0 dni

52

31 dni

5

0 dni

15

31 dni

2

Nicotiana

Brassica

Tabela 3. Wpływ stanu fizjologicznego rośliny matecznej na przebieg androgenezy.

Kultury izolowanych mikrospor są znacznie bardziej skomplikowane niż kultury pylników, jednak zapewniają rozwój embrionu wyłącznie z jednej komórki, co zapobiega tworzeniu chimer. W procesie androgenezy hodowane są więc albo izolowane mikrospory (kultury izolowane), albo ziarna pyłku (na wiszących kroplach). 3. Pozostałe metody otrzymywania roślin haploidalnych. Problemy związane z kulturami haplontów. Alternatywną, o wiele rzadziej wykorzystywaną metodą otrzymywania organizmów haploidalnych są kultury zalążni, które można tworzyć z niezapłodnionych komórek jajowych zwaną gynogenezą. Technika ta jest mniej popularna ze względu na znacznie mniejszą dostępność żeńskich komórek generatywnych. Niemniej jednak, tak jak w przypadku androgenezy rozwój całych roślin może odbyć się na drodze embriogenezy lub organogenezy. Gynogeneza stosowana jest dla gatunków z rodzin, u których nie zachodzi proces androgenezy: • Liliaceae (liliowate); • Compositae (astrowe). Innym sposobem produkcji haplontów jest traktowanie rozwijających się siewek kolchicyną, jednak jest to metoda bardzo czasochłonna i dająca niskie plony ze względu na fakt, że większość roślin nie przeżywa ekspozycji na ten alkaloid. Mimo dobrze opracowanych metod wytwarzania roślin haploidalnych mogących być wykorzystywane w rolnictwie często spotyka się na problemy: • jeśli pylniki nie wykazują zdolności do wzrostu to nie ma możliwości uformowania embrionów; • powstająca tkanka lub kalus może być diploidalna lub poliploidalna poprzez możliwość powstawania chimer; • rośliny formujące się w wyniku androgenezy często są albinotyczne; • niska wydajność androgenezy niektórych z gatunków eliminuje możliwość zastosowań komercyjnych; • niewielka możliwość stosowania hormonów w czasie hodowli (ich obecność sprzyja większej ploidalności komórek); • otrzymywane podwójne haplonty czasami nie są homozygotyczne, a segregacja cech może uwidocznić się dopiero u roślin potomnych....