Wirusy bakterii: bakteriofagi. PDF

Preview

Summary

Wykładowca: prof. dr hab. Tadeusz Kaczorowski; dr hab. Iwona Mruk; dr Ewa Wons; mgr Dawid Kościelniak; mgr Karolina Wilkowska; dr hab.Beata Furmanek-Blaszk; dr Magdalena Płotka; dr Ewa Wons (Katedra Mikrobiologii). Punkty ECTS: 3. Spis treści: Wirusy. Cykl rozwojowy bakteriofaga λ. Regulacja cyklu l...

Description

Mikrobiologia Ćwiczenie 6. Bakteriofagi. Wspólnym czynnikiem wirulencji wszystkich bakterii z rodziny Enterobacteriaceae są endotoksyny! 1. Wirusy. Cykl rozwojowy bakteriofaga λ. Wirusy – bezwzględne, wewnątrzkomórkowe pasożyty organizmów żywych. Bez obecności gospodarza wirusy nie są w stanie się namnażać i nie wykazują żadnych funkcji życiowych. Ponieważ ściśle wykorzystują maszynerię komórkową swojego żywiciela, stąd też często zawężają grupę organizmów, które wybierają do przeprowadzenia swoich cykli rozwojowych. Wirusy infekujące komórki bakteryjne nazywa się bakteriofagami. Twory te można podzielić na wiele sposobów, biorąc pod uwagę między innymi: Ø kształt • helikalne; • wielościenne (kubiczne); o iksoaedralne – najczęściej spotykane, dwudziestościenne; • mieszane; Ø posiadanie otoczki • wirusy otoczkowe; • wirusy bezotoczkowe; Ø rodzaj materiału genetycznego – wirusy różnią się od żywych komórek tym, że zawierają zawsze tylko jeden rodzaj kwasów nukleinowych: • DNA wirusy; • RNA wirusy; Ø ilość nici materiału genetycznego • jednoniciowe; • dwuniciowe; Ø uporządkowanie materiału genetycznego • kolisty; • liniowy; • segmentowy. np. wirus grypy posiada w swoim kapsydzie jednoniciowy kwas RNA w ośmiu segmentach. Wirion, czyli pojedyncza cząstka wirusowa zdolna do infekcji i przebywania poza komórkami gospodarza składa się z kwasu nukleinowego, który otoczony płaszczem białkowym – kapsydem. Ten zbudowany jest z podjednostek zwanych kapsomerami. Istnieją dwa rodzaje genów wirusowych: 1) geny struktury – odpowiedzialne za kodowanie powstawania składników budulcowych wirionu; 2) geny regulatorowe – odpowiedzialne kodowanie komponentów za wyciszających metabolizm gospodarza i nastawiających jego komórki na produkcję nowych wirionów. Escherichia coli jest gospodarzem dla m.in. trzech wirusów: bakteriofaga T4, bakteriofaga λ oraz bakteriofaga filamentującego M13. Atakuje on tylko komórki męskie, przyłączając się do pili płciowej. Charakteryzuje się tym, że jego materiał genetyczny stanowi jednoniciowy DNA, do którego od razu po zainfekowaniu komórki zostaje dobudowana nić komplementarna. Fakt ten jest wykorzystywany w biotechnologii do produkcji wektorów lub matryc kwasów nukleinowych.

Wszystkie komponenty strukturalne bakterii mające styczność ze środowiskiem zewnętrznym – ściana komórkowa, LPS, białka, lipoproteiny – mogą stanowić receptory, dzięki którym bakteriofagi rozpoznają i przyłączają się do odpowiedniego gospodarza. Najbardziej zbadanym, wręcz modelowym bakteriofagiem Escherichia coli jest bakteriofag λ, dla którego receptorem jest permeaza maltozy, produkt genu LamB. Wykorzystując swoje włókna, bakteriofag przyłącza się do permeazy i wstrzykuje swój DNA do cytoplazmy bakterii. DNA faga λ to dwuniciowa, liniowa czasteczka z lepkimi końcami 5’ o wielkości 48502 pz. Po wniknięciu kwasu nukleinowego do Escherichia coli ulega cyrkuralizacji i na tym etapie dochodzi do fazy decyzji jaki cykl rozwojowy powinien zostać podjęty: Ø lizogeniczny – DNA zostaje wbudowane do chromosomu bakteryjnego, a wirus przechodzi w stadium profaga; Ø lityczny – od razu zachodzi replikacja genomu; model replikacji θ lub σ (nazwy pochodzą od kształtu widełek replikacyjnych, które przypominają te dwie litery greckie), następuje synteza i składanie cząstek wirusowych, a gotowe wiriony są wypuszczane do środowiska w procesie lizy gospodarza. Bakteriofag λ integruje się w ściśle określonym miejscu w genomie bakterii. Jest miejsce występujące pomiędzy operonem gal a operonem bio – sekwencja attB od strony bakterii lub attP od strony bakteriofaga. Fagowe białko integraza (int) rozpoznaje tę sekwencje, przecina je i przeplata nici kwasu nukleinowego w wyniku czego dochodzi do włączenia DNA bakteriofaga do genomu bakterii. W tej integracji oprócz integrazy bierze udział bakteryjne białko IHF, które przyłącza się do DNA i uwypukla sekwencje att ułatwiając do niej dostęp. Możliwa jest również reakcja odwrotna. Konieczna do tego jest aktywność trzeciego białka – xis, czyli ekscynazy. Rozpoznaje ono identyczne sekwencje na jednej cząsteczce już zintegrowanego materiału genetycznego, przecina i uwalnia DNA fagowe. Proces włączenia DNA fagowego nosi nazwę rekombinacji miejscowo-specyficznej. Różni się ona od rekombinacji homologicznej, w której do reakcji potrzebny jest bardzo długi, podobny do siebie odcinek DNA. W przypadku łączenia kwasów nukleinowych bakterii i faga wymagana specyficzność odcinków jest bardzo krótka.

2. Regulacja cyklu litycznego bakteriofaga λ. Początek zakażenia: znalezienie i wylądowanie na powierzchni bakterii przez bakteriofaga następuje przez przyczepienie się włóknami do specyficznego receptora. Następnie wirus penetruje osłony komórkowe i kwas nukleinowy jest wstrzykiwany do wnętrza bakterii. Większość bakteriofagów posiada DNA jako swój genom. Samo zakażenie jest zależne od stanu fizjologicznego komórki. Młode komórki bakteryjne łatwiej ulegają zakażeniu niż komórki stare, co jest związane z obecnością receptorów i większą ekspresją różnych białek. Do zakażenia potrzebna jest obecność jonów dwuwartościowych, odpowiednie pH lub odpowiednia temperatura. Faza penetracji - obecny kwas nukleinowy w komórce, ale jeszcze brak syntezowanych białek. W przypadku wejścia w cykl lityczny następuje synteza regulatorowych, wyciszających metabolizm gospodarza białek wczesnych, które kierują całą maszynerię komórkową na replikację oraz ekspresję własnych genów późnych. Białka strukturalne wytworzone w późniejszych fazach zakażenia często charakteryzują się powinowactwem samych do siebie przez co samoistnie się składają i nie wymaga to procesów enzymatycznych. Po złożeniu wirionu dochodzi do lizy komórki i uwolnienia cząstek potomnych wirusa.

3. Mechanizm lizogenizacji. Cykl lizogeniczny – DNA faga integruje się z nukleoidem do stadium profaga. W tym etapie większość genów bakteriofaga jest wyciszonych. Ekspresji ulegają tylko te geny, które utrzymują stadium wyciszenia wprowadzonego genomu fagowego. Profag zachowuje się jak część składowa genomu bakterii. Replikuje się, jest przekazywany komórkom potomnym, ale może się wyciąć w warunkach stresowych np. w wypadku uszkodzenia DNA. To czy dojdzie do lizy czy lizogenizacji bakteriofaga wynika ze wzajemnego stosunku dwóch białek: CI i Cro. CI kieruje faga w kierunku lizogenii, Cro w kierunku lizy, a obecność białek jest uzależniona obecnych warunków środowiskowych. Oba te białka mają powinowactwo do tego samego rejonu DNA, rejonu decyzyjnego zwanego operatorowym, zlokalizowanym pomiędzy dwoma promotorami, które są skierowane przeciwnie do siebie. Białko CI ma największe powinowactwo do operatora I, najniższe do III – białko Cro – odwrotnie. Przyłączenie się białka CI do pierwszego operatora blokuje możliwość transkrypcji i ekspresji genów z tego promotora przez polimerazę RNA co blokuje wejście w cykl lityczny. Białko Cro natomiast, blokuje ekspresję genów odpowiedzialnych za cykl lizogeniczny. CI – białko represorowe faga lambda. W stanie lizogenii (profaga) wszystkie geny są wyciszone powstaje tylko białko CI, integraza oraz pozostałe białka za utrzymywanie stadium lizogenii.

4. Fagi lityczne i lizogenizujące. Cykle życiowe i warunki im sprzyjające. Bakteriofagi można podzielić ze względu na strategie rozwojowe jakie są w stanie przeprowadzić: Ø wirulentne, zjadliwe – zawsze kończą swój cykl rozwojowy lizą gospodarza, nie wchodzą w cykl lizogeniczny, są zdolne jedynie do inhibicji lizy. Ø łagodne, niezjadliwe – w zależności od warunków środowiskowych mogą wejść albo w cykl lityczny albo lizogeniczny. CYKL LITYCZNY niskie stężenie cAMP bogata pożywka niska wielokrotność mało fagów przypada na zakażenia jedną komórkę (1-2) wysoka temperatura przyspiesza metabolizm

CYKL LIZOGENICZNY wysokie stężenie cAMP uboga pożywka wysoka wielokrotność dużo fagów przypada na zakażenia jedną komórkę (ok. 5) niska temperatura spowalnia metabolizm

cAMP – cząsteczka znamionująca głód. W warunkach korzystnych jest niski jak w przypadku cyklu litycznego.

Jaki cykl rozwojowy opłaca się bardziej bakteriofagowi λ? Lityczny, ponieważ prowadzi do produkcji setek lub tysięcy cząstek potomnych. W warunkach dogodnych, bakteriofag ma zapewnione dobre warunki rozwoju, pomnożenia i zarażenia innych bakterii. Jeżeli warunki są gorsze, bardziej opłaca się przejść w cykl lizogeniczny i poczekać na bardziej obfity okres w życiu bakterii, jednak spowalnia to okres wytworzenia populacji fagów potomnych i dalszego ich rozprzestrzenienia, na którą jest nastawiony bakteriofag. Aktywność bakteriofagów litycznych obserwuje się na murawie bakteryjnej, na której pojawiają się łysinki ze zlizowanymi bakteriami a w hodowli płynnej w postaci przejaśnień oraz „kłaczków” utworzonych z martwych komórek bakterii Escherichia coli λCIts – szczep Escherichia coli zarażonej fagiem lambda temperaturo-wrażliwym z represorem białka CI, który jest aktywny w 30°C, a w 42°C staje się niefunkcjonalny. Po odmłodzeniu nocnej hodowli wybranego szczepu w 30° następuje namnażanie bakterii lizogennych. Przeniesienie do 42 stopni (utrata aktywności przez białko CI) – dochodzi do indukcji profaga (wycięcia faga z genomu) i jego przejście w cykl lityczny, co skutkuje śmiercią bakterii i jest widoczne w postaci przejaśnień w hodowli bakteryjnej. 5. Superinfekcja. Superinfekcja, czyli nadkażenie, to sytuacja, do której dochodzi, kiedy do istniejącej i trwającej aktualnie infekcji, dołącza się i następnie rozwija kolejna wywołana innym patogenem. Do takiej sytuacji dochodzi chociażby w momencie, gdy do toczącego się wirusowego zapalenia dróg oddechowych dołącza się infekcja bakteryjna, powodując zapalenie oskrzeli. Bakteria, która jest w lizogenii z danym fagiem, nie może być ponownie nim zarażona, jest oporna na fagi tego samego gatunku. Nie zachodzi do superinfekcji bakteriofagiem λ bakterii, która jest już nim zakażona, ale może dojść do nadkażenia przez innego faga np. T4. 6. Fagi męskie, fagi żeńskie. Cecha bakteriofagów, która określa zdolność ich przyłączenia do receptorów kodujących pile płciowe, określanych przez czynniki F i Hfr. Niektóre z bakteriofagów są w stanie przyłączyć się do komórki „męskiej” F+, posiadającej długi pilus płciowy, a do komórek „żeńskich” posiadających pilusy krótsze – już nie. Taki bakteriofagiem jest wirus M13. 7. Obliczanie miana faga. Obliczanie miana faga (Mf), czyli liczbę cząstek fagowych w 1 ml zawiesiny można wykonać sotsując wzór: 𝑴𝒇 = 𝒏% ×% 𝟏𝟎𝑿 % × %𝟏𝟎 gdzie: Mf – miano faga; n – ilość łysinek fagowych; 10X – rozcieńczenie lizatu fagowego; 10 – lub jakakolwiek inna liczba, przez którą należy pomnożyć objętość użytego lizatu fagowego, aby otrzymać wynik 1 ml. W tym przypadku wysiano 0,1 ml lizatu, dlatego trzeba pomnożyć wynik przez dziesięć.

8. Konwersja lizogenna. Konwersja lizogenna – w wyniku wbudowania się DNA fagowego w genofor dochodzi do ekspresji związanych z daną cechą genów bakteryjnych, które były obecne w nukleoidzie, ale w postaci wyciszonej. Przykładem jest maczugowiec błonicy (Corynebacterium diphtheriae), który w stanie lizogenii wytwarza toksynę. Gen kodujący ten związek nie pochodzi od profaga – jego wbudowanie tak zmieniło otoczenie genetyczne, że gen bakterii się uaktywnia....