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Genetischer Code...

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Translation Genetischer Code - Ist universell, d.h. in allen Lebewesen auf der Erde wird derselbe Code verwendet - Einige Ausnahmen der Universalität: mitochondriale DNA, die nicht vollständig dem Standardcode folgt - Code legt fest, welche Basen welche AS codieren - Gruppe von 3 Basen = Triplet, Codon - Triplet codiert bestimmte AS und bestimmt ihre Position im Protein - In DNA und RNA kommen 4 Basen vor → rechnerisch lassen sich 4^3 = 64 AS verschlüsseln - Proteine unserer Zellen sind jedoch nur aus den 20 bzw. wenn man Selenocystein, Pyrrolysin und SElenomethionin berücksichtigt, 23 AS aufgebaut - Bietet die Möglichkeit, dass mehrere Codons eine AS codieren können, was tatsächlich der Fall ist - Für fast alle AS gibt es mehrere Codons – manche bis zu 6 versch. Codons -

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Codonsonne: o Eine AS wird von den beiden ersten Basen des Codons bestimmt o Dritte Position kann von utnerschiedlichen Basen besetzt sein o Codierte AS ändert sich dadurch nicht o Code ist dahier in Richtung des üblichen Informationsglusses von der DNA über die RNA zum Protein zwar eindeutig, allerdings kann man nicht ovn einer AS auf ein Codon schließen → deshalb bezeichnet man den genetischen Code auc hals degeneriert oder redundant! o Codonsonne ist eine Darstellungsform des genetischen Codes o Sie wird von innen nach außen gelesen o Im Zentrum sind die Basen am 5’Ende des Codons auf der mRNA, dann folgt die mittlere Base und im äußersten blauen Kreis stehe ndie Basen am 3’Ende o Ganz außen lässt sic hdann die von dem Triplett codierte AS ablesen o Beispiel: 5’UCU-e’ codiert Serin

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AUG o Startcodon! o Signal für die Initiation der Translation o Codiert Methionin (bei Prokaryoten Formylmethionin) UAA, UAG, UGA: o Stoppcodons o Termination der Translation Da es keine entsprechenden mit AS beladenen tRNA-Moleküle gibt, die an die Codons binden, wird das synthetisierte Polypeptid freigesetzt, wenn das Ribosom eines dieser drei Codons erreicht

Sonderfälle: selenocystein, Pyrrolysin, Selenomethionin - Genetische Code spezifiziert neben den 20 „normalen“ proteinogene AS, die in allen bisher darauf untersuchten Organismen vorhkommen tatsächlich 23 AS - Die drei zusätzclichen AS sind das als 21. AS bezeichnete Selenocystein, Pyrrlysin (22. AS) und SElenomethionin (23.AS) Wichtig: Genetische Code Wichtig sind Start- und Stoppcodons: - Start: AUG - Stopp: UAA, UAG, UGA Transfer-RNA (tRNA): - Werkzeuge, mit deren Hilfe die Basensequenz einer mRNA und damit eines Gens in die AS-Sequenz eines Proteins übersetzt wird, indem sie die richtige AS zu der von der Basensequenz vorgegbeenen Posiiton dirigiern Struktur und Funktion der tRNA - Es gibt ca. 30 versch. tRNA-Moleküle, die von der DNA codiert und deren Vorläufermoleküle von der RNA-Polymerase III synthetisiert werden - Vorläufermoleküle werden posttranskriptionell modifiziert → fertige tRNA-Moleküle haben einen hohen Gehalt an seltenen Nucleosiden wie Pseudouridin, Inosin und methylierte Formen von A,C,G und U - Alle tRNA gemeinsam: o 70-90 Nucleotide o intramolekulare H-Brü+cken → zwischen komplementären Basen bidlen sie eine ausgeprägte Sekundärstruktur aus (Kleeblattstruktur) - sind Vermittler zwichen Nucleotidsequenz der mRNA und der AS-Sequenz der Proteine → besitzen deshalb besondere Strukturmerkmale: o Anticodonarm: ▪ Enthält ein für dieses tRNA-Molekül spezifisches Basentriplett (Anticodon) das zu einem bestimmten Basentriplett auf der mRNA (Codon) komplementär ist und mit ihm H-Brücken eingeht o Akzeptorarm: ▪ Besteht aus dem 5’- und dem 3’-Ende des tRNA-Moleküls, die einen doppelsträngigen Abschnitt, einem Stamm, ausbilden, wobei das 3’Ende den Stamm mit der für alle tRNAs typischen Nucleotidfolge CCA überragt

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An das Adenosinmonophosphat von CCA wird die Aminosäure gebunden → hat also Bindugnsstele für die Aminosäure

o D-Arm: ▪ Enthält Dihydrouridin ▪ Besteht aus einem Stamm und einer Schleife mit variabler Länge o T-Arm: ▪ Enthält Pseudouridin (ψ), das stehts umgeben von Thymin und Cytosin vorkommt → Daher auch als T ψC-Arm bezeichnet o Variable Schleife: ▪ Eine Schleife mit einer variablen Ausdehnung Sekundärstruktur der tRNA

Bindung des Anticodon an das Codon Beispielaufgabe: Codon 5’UUU-3’ 5’-UGU-3’ 5’-UGA-3’ 5’-AUG-3’

Codierte AS Phenylalanin Cystein Stoppcodon Startcodon

Aufgabe: Welches Anticodon trägt die tRNA, mit der SElenocystein bei der Translation eingebaut wird 5’-AAA-3’, 5’-ACA-3’, 5’-AGA-3’, 5’-CAU-3’, 5’-UCA-3’ Lösung: Man muss zunächst wissen, dass die Selenocystein-tRNA an ein Stoppcodon bindet Dann uss man das zum Codon krekkt orientierte Anticodon finden

DA Codon und Anticodon antiparellel binden, lautet das zum Stoppcodon 5’ -UGA-3’ komplementäre Anticodon 5’-UCA-3’ Lösung: 5’-UCA-3’

Merke: Codon: - Gruppe aus 3 Nucleotiden (Triplett) auf der mRNA, die die Position einer AS im Protein bestimmt bzw. einen Translationsstopp codiert Anticodon: - Gruppe aus 3 Nculeotiden (Triplett) auf der tRNA, die zu einem Codon auf der mRNA komplementär ist Wobble-Hypothese: - Bindung der mittleren und der letzten Base (3’-Base) des Anticodon an die Basen des Codons entpsricht genau der Standardbasenpaarung - Erste Base (5’-Base) des Anticodons der tRNA kann aber an die dritte Base (3’Base) des Codons auf der mRNA macnhmal ungenau sein (Wobble-Hypothese) - Ungenauigkeit geht auf sterische Behinderungen in der Anticodonschleife und die Ausbildugn von nur schwachen H-Brückenbindungn zurück, tritt u.a. auf, wenn sich Inosin (mit der Base Hypoxanthin) in der 5’Position des Anticodons befindet - aber auch andere Basen an dieser Stelle „schwanken“ in ihrer Partnerwahl → 5’Position des Anticodons einer tRNA wird deshalb auch als „Wobble-Position“ (Wackelnde Position) bezeichnet → zeichnet sich dadurch aus, dass die Basen an dieser Stelle besonders häufigk nicht die klassischen Basen als Bausteine entahtlen - dieselbe tRNA kann mit ihrem Anticoodon mehrere Codons erkennen, wobei sie aber immer die gleiche AS trägt Möglichkeiten zum Wobble Oben: - befindet sich Insoin an der 5’Position des Anticodons (Wobble-Position) - kann tRNA an drei Codons binden - -5’-GCU-3’, 5’-GCA-3’, 5’-GCC-3’ unten: - befindet sich Guanin an der 5’Position des Anticodons - kann tRNA an zwei Codons binden - -5’-CUC-3’, 5’-CUU-3’

Beladung der tRNA mit einer Aminosäure -

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Bildung einer Aminoacyl-tRNA durch Anheften der passenden AS an das 3’Ende einer bestimmten tRNA ist von zentraler Bedeutung für Umsetzung des genetischen Codes Geschieht durch Aminoacyl-tRNA-Synthetasen Jede Aminoacyl-tRNA-Synthetase ekrennt eine AS und heftet diese spezifisch an ein tRNA-Molekül mit einem ganz bestimmten Anticodon → enzyme sind spezifisch für eine AS und ein tRNA-Molekül In allen Zellen gibt es mindestens 20 versch. Synthetasen, eine für jede AS Beladung findet im Zytosol statt: o 1. Aktivierung der reaktionsträgen AS: ▪ ATP, Aminosäure und tRNA lagern sic han die Aminoacyl-tRNASynthetase ▪ Unter Abspaltung von Pyrophosphat (PPi) wird AMP an die AS gebunden und es entsteht ein Aminoacyladenylat (Aminoacyl-AMP) o 2. Bidnung der AS an die tRNA: ▪ Aminoacyl-tRNA-Synthetase überträgt die AS unter Freisetzung von AMP auf das Adenosinmonophosphat am 3’Ende der tRNA ▪ Enstehung eier Esterbindung zwischen der Carboxy-(COOH-) gruppe der AS und einerd er beiden Hydroxyl(OH-)Gruppen der Ribose im Adenosin

Ribosomen: - Übernehmen bei dem komplexen Prozess der Übersetzung der Nucleotidsequenz einer mRNA in die AS-Sequenz eines Proteins (Translation), der im Zytosol stattfindet, eine zentrale Funktion - Währen der Translation gleiten sie an der mRNA entlang und organisieren das Ablesen der Information und die Verknüpfung der AS in der richtigen Reihenfolge - Können die mRNA frei im Zytosol translatieren (das gilt für zytosolische Proteine wie auch Proteine, die für Mitochondrien, Zellkern und Peroxisomen bestimmt sind) oder auch gebunden an die Membran des ER, direkt in das Lumen des rER - Kommen sowohl ind Pro- als auch in Eukaryoten vor: o Gemeinsamkeiten: ▪ Zwei Untereinheiten, eine kleine und eine große, die erst während der initiation der Trnalsation nacheinander zur mRNA dirigiert werdne, ansonsten aber getrennt von einander im Zytosol vorliegen ▪ Jede untereinheit besteht aus 1-3 rRNA-Molekülen und aus vielen untersch. Proteinen! - Zusammensetzung, Größe und Dichte von pro- und eukaryotischer Ribosomen weisen Utnerschiede auf, die sich auf die Sedimentationsgeschwindigkeit der Ribosomen bei der Ultrazentrifugation auswirken - Sedimentaitonsgeschwindigkeit wird mit der Einheit S (von Svedberg) angegeben: Unterschiede in der Ribosomenzusammensetzung zwischen Pro- und Eukaryoten Bauteil Kleine Untereinheit

Große Untereinheit

Komplettes Ribosom S, Sedimentationskonstante

Prokaryoten 30S - 16S-rRNA - 21 Proteine 50S - 23S-rRNA, 5S-rRNA - >30 Proteine 70S

Eukaryoten 40S - 18S-rRNA - 33 Proteine 60S - 28S-rRNA, 5,8SrRNA, 5S-rRNA - 49 Proteine 80S

Eukaryotische Ribosomen: - sind größer und komplexer aufgebaut aus die der Prokaryoten - Transkription der rRNA-Gene findet im Nucleus statt: - Mit Ausnahme der 5S-rRNA (Synthese durch die RNA-Polymerase III) werden rrNAs von der RNA-Polymerase I als ein 47S-Vorläufermolekül (Prä-rRNA) synthetisiert, aus dem während der Ribosomenreifung die einzelnen rRNA-Moleküle freigesetzt werden - Dabei und bei der weiteren Modifikation von rRNA- und snRNA-Nucleotiden im Nucleolus spielen snoRNA (Small nucleolar RNAs) eine wichtige Rolle - snoRNAs sind mit Proteinen wie dem stark, methylierten, basischen Protein Fibrillarin und anderen Proteinen zu snoRNPs (small nucleolar Ribonucleoproteins) assoziiert - Während der RNA-Anteil des snoRNP über Basenpaarung zu seinem bestimmungsort auf der Vorläufer-rRNA dirigiert, übernimmt der Proteinanteil z.b. die Methylierung

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der Ribose, wie es beim Fibrillarin der Fall ist, doer auch die Isomerisierung von Uridin zu Pseudouridin Untereinheiten eukaryotischer Ribosomen werdne bereits im Nucleolus mithilfe von zahlreichen weiteren Proteinen zusammengesetzt und durch die Kernpore ins Zytosol transportiert

Translation: Ablauf, Regulation und Hemmstoffe Ablauf der Translation -

Zentrale Mechanismen der Knüpfung einer Peptidbindung zwischen Pro- und Eukaryoten ähneln sich stark bei beiden dient GTP als unmittelbare Energiequelle für versch. Reaktionen im Verlauf der Translation

Initiation der Translation: -

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Für die Initiation der Translation werden mehr als ein Dutzend eukaryotische Initiationsfaktoren (eIFs) benötigt, die die ribosomalen Untereinheiten zum Startcodon dirigieren Bei der Initiation spiele nauc hdie 5’-Cap-Struktur und der Poly(A)-Schwanz am 3’Ende der mRNA eine wichtige Rolle Beginn der Initiation: o mRNA und die beiden ribosomalen Untereinhetein liegen frei im Zytosol vor o an 40S-Untereinheit sind zwei eIFs gebunden, um die vorzeitige Anlagerung der 60S-Untereinheit zu verhindern (1 im Bild) o eIF2 (eIF2-GTP): ▪ methioninbeladene Initiations-tRNA (Met-tRNAi) bidlet zusammen mit dem GTP-gebundenen Initiationsfaktor eIF2 einen ternären Komplex, der mit der 40S-Untereinheit zum 43S-Präinitiationskomplex assoziiert (2 im Bild) für Vorbereitung der mRNA bindet der Initiationsfaktor eIF4F, der aus 3 Untereinheiten besteht, an die mRNA (3 im Bild): o 1. Unterheit bindet an die Cap-Struktur am 5’Ende der mRNA o 2. Untereinheit ist eine ATP-abhängige RNA-Helikase und löst vermutlich Sekundärstrukturen in der 5’-untranslatierenden Region (5’UTR) der mRNA o 3. Untereinheit dient mit ihren zahlreichen Bindungsstellen als eine Art adapter, der die Funktionen und die beteiligten Komponenten rekrutiert im nächsten Schritt lagert sic hdie kleine ribosomale Untereinheit an die mRNA (4 im Bild) dazu tritt eine Untereinheit von eIF4F in Kontakt mit einem gebundenen Initiationsfaktor und zieht so den 43S-Präinitiationskomplex zur mRNA der 48S-Präinitiationskomplex wird gebildet (5 im Bild) o dieser bwegt scih entlang der 5’UTR, bis er auf ein passendes Startcodon (AUG) trifft und sich eine Basenpaarung zwiscehn AUG und dem Anticodon der Met-tRNAi ausbildet (6 im Bild) (auch Scanning genannt) Startcodon ist in der Regel das erste AUG nach der Cap-Struktur Erste AS, die bei der Translation eukaryotischer mRNA in Protein eingebaut wird , ist stets Methionin

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Codon-Anticodon-Bindung führt zur Hydrolyse des GTP und zur Freisetzung von eIF2GDP und der anderen Initiationsfaktoren (7 im Bild) Im letzten Schritt der initiation bindet die ribosomale 60S-Untereinheit unter Mitwirkung eines weiteren Initiationsfaktors und der 80S-Initiationskomplex aus der ribosomalen 40S- und 60S-Untereinheit, mRNA und Inititations-tRNA ist komplett (8 im Bild)

Initiation der Translation bei Eukaryoten: 1. Bindung von zwei eukaryotischen Initiationsfaktoren (eIF) an die kleine ribosomale Untereinheit 2. Anlagerung des Komplexes aus Initiations-tRNA, eIF2 und GTP und eines weiteren eIF an die kleine ribosomale Untereinheit und Ausbildung des 43SPräinitationskomplexes 3. Bindung von eIF4F an die mRNA 4. Anlagerung des 43S-Präinitationskomplexes an die mRNA 5. Ausbildung des 48S-Präinitiationskomplexes und Scanning der mRNA 6. Bindung des Anticodons der Initations-tRNA an das Startcodon AUG 7. Hydrolyse von GTP und Freisetzung der eIFs 8. Bindung der großen ribosomalen Untereinheit und Bildung des 80SInitationskomplexes

Nicht alle der im Verlauf der Initiation vorkommenden Hydrolysen von GTP oder auch ATP sind dargestellt

Regeneration von eIF2-GTP: - eIF2 gehört zu den heterotrimeren G-Proteinen und kann GTP binden und auc hhydrolisieren - es liegt nach erfolgreicher Initiation in GDP-gebundener, inaktiver Form vor, in der es keine neuen Initiations-tRNAs binden kann, und muss recycelt werden - eIF2-GDP wird mithilfe des Guaninnucleotidaustauschfaktors eIF2B, der das GTP ersetzt, wieder in seine aktive Form, eIF2-GTP, überführt - Dieses Recycling ist ein wichtiger Ansatzpunkt für die Regulation der Translation Regeneration von eIF2-GTP: - Bevor eIF2 w ieder an eine Initiations-tRNA binden kann, muss GDP durch GTP ersetzt werden - Bindung von eIF2-GDP an den Guaninnucleotidaustauschfaktor eIF2B führt zur Freisetzung von GDP - Anschließend kann eIF2 wieder ein GTP binden und leigt nun wieder in seiner aktiven Form, eIF2-GTP, vor

Elongation der Translation -

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3 Bindungsstellen, an denen die mRNA einzelsträngig ist und eine tRNA mit ihrem Anticodon binden kann: o A-Stelle (Akzeptorstelle): ▪ Während der Elongation Bindung der nächsten Aminoacyl-tRNA o P-Stelle (Peptidylstelle): ▪ Im Initiationskomplex Bindung der Initiations-tRNA, während der Elongation Bindung der Peptidyl-tRNA o E-Stelle (Exitstelle): ▪ Bindung der deacetylierten tRNA vor ihrer Freisetzung Elongation läuft mithilfe von Hilfsproteinen ab (eukaryotische Elongationsfaktoren (eEFs), Zahl der Faktoren ist jedoch wesentlich geringer als bei der Initiation der Translation

Bindung einer Aminoacyl-tRNA an die A-Stelle -

Initiations-tRNA Met-tRNAi an die P-Stelle gebunden, A-Stelle mit dem nächsten Basentriplett ist frei nächsten Basentriplett ist Frei

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Um die freie Stelle zu besetzen, ist der Elongationsfaktor eEF1alpha erforderlich, er ist wie eIF2 ein G-Protein, das durch die Bindung von GTP aktivert wird eEF1alpha-GTP findet in ternären Komplex mit der nächsten Aminoacyl-tRNA die freie A-Stelle und bindet dort über eine komplementäre Basenpaarung an das Codon eEF1alpha hydrolysiert GTP zu GDP und Pi und kann sich anschließend vom Ribosom lösen nun sind zwei Bindungsstellen des Ribosoms von tRNa-Molekülen besetzt

Regeneration von eEF1alpha-GTP: - eEF1alpha-GDP kann keine neue Aminoacyl-tRNA binden - Damit es seine Funktion am Ribosom wieder ausüben kann, muss das GDP durch GTP ersetzt werden - Diese Reaktion wird druch eEF1beta beschleunigt

Elongation der Translation bei Eukaryoten -

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Im initiationskomplex ist die initiations-tRNA an die P-Stelle gebunden, die A-Stelle mit den nächsten Basentriplett ist frei Der eukaryotische Elongationsfaktor eEF1alpha-GTP liefert die zweite AminoacyltRNA an Diese bindet an das Codon in der freien A-Stelle und das an eEF1alpha gebundene GTP wird zu GDP hydrolysiert Dann wird die Startaminosäure Methionin unter Ausbnildung einer Peptidbindung auf die zweite Aminosäure an der A-Stelle übertragen und die Bindung zwischen tRNA an der P-Stelle und ihrer Aminosäure wird gespalten (Peptidyltransfer) Mit Hilfe von eEF2-GTP und unter Hydrolyse des gebundenen GTP wandert das Ribosom um geanu ein Basentriplett auf der mRNA weiter (Translokation) tRNA an der E-Stelle wird freigesetzt, an der P-Stelle befindet scih die tRNA mit dem wachsenden Polypeptid und die A-sTelle ist wieder frei und bereit für die Aufnahme der nächsten beladenen tRNA in weiteren Elongationsrunden wird beim Peptidyltransfer dann nicht Methionin, sondern die gesamte wachsende Peptidkette auf die AS an der A-Stelle übertragen. A-Stelle: Akzeptorstelle, E-Stelle: Exitstelle, P-Stelle: Peptidylstelle

Bildung der Peptidbindung:

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Freie NH3-Gruppe (Aminogruppe) der AS an der A-Stelle greift das C-Aton der veresterten Carboxylgruppe der AS an der P-Stelle nucleophil an - Bindung zwischen der tRNA an der P-Stelle und ihrer AS wird gespalten und eine Peptidbindung zur AS an der A-Stelle wird ausgebildet - In der ersten Elongationsrunge: o Wird so die Startaminosäure Methionin auf die zweite AS übetragen - In weiteren Elongationsrunden: o tRNA trägt an der P-Stelle dann nicht nur Methionin, sondern die wachsenden Peptidkette o ihre Übertragung auf die AS an der A-Stele wird deshalb PEPTIDYLTRANSFER bezeichnet - Peptidyltransfer: o In der 60S-Untereinheit des ribosoms lokalisiert, genauer in der 28S-rRNA ,die augrund ihrer katalytischen Aktivität auch als Ribozym bezeichnet wird - Poplypeptidsyntehse: o Findet deshalb am Ribosom vom N- zum C-Terminus statt, wobei die Nterminale AS der wachsenden Peptidkette Methionin ist Peptidyltransfer:

Translokation und Freitsetzun der tRNA - ist die Peptikbindung geknüpft, gleitet das Ribosom auf der mRNA exakt drei Basenpositionen in richtung 3’Ende weiter -→ wird als Translokation bezeichnet - für Translokation ist Elongationsfaktor eEF2 nötig, der auch als Translokase bezeichnet wird und ebenfalls ein G-Protein ist - eEF2 lagert sic hreversibel an das Ribosom und bewikrt, dass die Peptidyl-tRNA von der A-Stelle an die P-Stelle verschoben wird - bei Translokation wird GTP in GDP gespalten - tRNA besetzt mit wachsendem Peptid die P-Stelle - A-Stelle ist wieder frei und kann eine neue Aminoacyl-tRNA aufnehmen - Leere tRNA befindet isc hdann in der E-Position, von der aus sie das Riboson verlässt Wichtig: Schritte der Elongation: Zyklischer Prozess aus drei sic hwiederholenden Schritten: 1. Bindung einer Aminoacyl-tRNA an die A-Stelle 2. Ausbildung einer Peptidbindung

3. Enlanggleiten des Ribosoms auf der mRNA um ein Basentriplett (Translokation) und Freisetzung der tRNA Termination der Translation: - Eukaryotische Releasing-Faktoren (eRFs, auc hals Terminationsfaktoren beziechnet) sind beteiligt - Erscheint eines der drei Stoppcodons (UAA, UAG, UGA) an der A-Stelle, bindet daran keine tRNA, sondern eRF1 - eRF1 rekrutiert eRF3, ein G-Protein an mit GTPase-Aktivität - es sorgt dafür, dass die Peptidyltransferase die Peptidkette von der tRNA an der PStelle auf ein Wassermolekül überträgt → Carbodylende der Polypeptidkette wird aus der Bidnugn an das tRNA-Molekül entlassen → die eRFs vermitteln also die hydrolytische Spaltung der Peptidyl-tRNA-bidnung und Freisetzung der Peptidkette - mRNA und tRNA der uletzt eingebauten AS lösen sic hvom Ribosom, das in seine Untereinheiten zerfällt - meist binden währen der Proteinbiosyntehse mehrere Ribosomen an ein mRNAMolekül und bilden ein Polysom!!! Polysom: - mehrere Ribosomen binden an eine mRNA

Regulation der Tra...