1 Espectroscopía de dicroísmo circular para caracterización de proteínas PDF

Preview

Summary

Download 1 Espectroscopía de dicroísmo circular para caracterización de proteínas PDF

Description

Espectroscopia de dicroísmo circular párrafo Caracterización de Proteínas: Aplicaciones biofarmacéuticas 6.1 INTRODUCCIÓN

dicroísmo circular (CD) es un método espectroscópico óptico que explota la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente izquierda y derecha entregado

por

moléculas

ópticamente

activas

para

determinar

sus

configuraciones absolutas. Cuando se aplica a las proteínas, CD en el rango de longitud de onda UV lejano del espectro electromagnético (260e170 nm) se puede

utilizar

para

carac-terize

y

cuantificar

el

contenido

estructural

secundario en términos de a-helicoidal, b-hebra, y la estructura de un-ordenó . De ello se deduce que cualquier cambio resolubles que se producen debido a las interacciones con ligandos u otros restos o factores ambientales tales como cambios en el pH o la fuerza iónica pueden ser monitoreados. La señal de CD a partir de los residuos aromáticos triptófano, tirosina,

6.1.1 Teoría

6.1.1.1 Los orígenes físicos de señales de CD

Electromagnética (EM) de radiación comprende un campo eléctrico y un campo magnético que oscil-tarde en planos perpendiculares, que son, a su vez, perpendicular a la dirección de una luz prop-agation (Figura 6.1).

Una fuente de luz en general, da lugar a trenes de ondas con los campos orientados isótropa; selecciona de polarización lineal de luz con el oscilante campo eléctrico en un solo plano. en circularmente

Figura 6.1 polarizada linealmente radiación electromagnética. El campo eléctrico (E) y el campo magnético (B) son perpendiculares a la dirección de propagación y el uno al otro. l es la longitud de onda de la luz.

la luz polarizada (CPL), que gira el vector eléctrico sobre la dirección de propagación someterse-ing una revolución por longitud de onda, donde, mirando hacia la fuente de luz, CPL diestro girará en sentido horario y en sentido antihorario CPL zurdo.

Linear luz polarizada puede ser descrito como la superposición de la luz polarizada de forma opuesta circular de igual amplitud y fase. Mientras las amplitudes y fases de las componentes circulares siguen siendo los mismos, el vector eléctrico resultante (E) se encuentran en un plano y oscilan en magnitud como se muestra a la izquierda de la figura 6.2. Cuando pasa la luz a través de una muestra ópticamente activo, habrá absorbancia diferencial de las dos compo-nentes polarizadas circularmente y se dice que la radiación resultante a polarizarse elípticamente con un vector eléctrico rastreo de una elipse, como se muestra a la derecha de la figura 6.2. El espectro de CD se deriva de la diferencia en la absorción de izquierda y derecha CPL que emerge de la ópticamente activo

Figura 6.2 (izquierda): Vista a lo largo de la dirección de propagación de la luz, mirando hacia la fuente de la luz polarizada plana. El vector eléctrico (La flecha) es la suma de los componentes izquierdo y derecho con polarización circular (flechas sólidas). (Derecha): Después de pasar a través de una muestra ópticamente activa el componente polarizada circularmente a la izquierda se absorbe más que el derecho y el campo eléctrico traza una elipse.

FIGURA 6.3 La relación entre la absorción (arriba) y CD (parte inferior). Para CD, “A” indica cuando la luz polarizada circularmente a la izquierda se absorbe más de la derecha, lo que produce un pico positivo de CD; “B” es cuando la luz adecuada polarizadas circularmente se absorbe más de la izquierda, que produce un pico de CD negativa, y “C” es cuando derecha y izquierda

polarizada circularmente luz son absorbidos por igual (es decir, la muestra es aquiral), que no produce señal de CD.

muestra (Figura 6.3). Un cromóforo es ópticamente activo si es quiral, covalentemente unido a un centro quiral, o situado en un entorno de cortesía quiral de la estructura tridimensional de la molécula. Esta última situación se refiere al grupo de péptido columna vertebral, que es el cromóforo de interés principal en la proteína.

ABSORCIÓN 6.1.1.1.1 FAR-UV de la del enlace de péptido

Cuando electromagnética (EM) de radiación de una energía específica (en el UV o partes visibles del espectro) golpea un cromóforo, la absorción se produce si los electrones son transitoriamente promovidos desde un estado fundamental a un estado de energía más alto (Figura 6.4 izquierda). El enlace peptídico tiene dos

Figura 6.4 (izquierda): La absorción implica la promoción de un electrón a un estado de energía más alto. (Derecha): El estado excitado vuelve deslocalizada sobre los cromóforos y escisiones acoplados en dos o más estados de energías ligeramente diferentes.

FIGURA espectro 6.5 CD de una proteína en su mayoría a-helicoidal (mioglobina) [línea continua], una proteína principalmente b-hoja, (lectina de lenteja) [línea de puntos], y una proteína desordenado (MEG-14) [línea de puntos]. (Fuente:. Los datos de [1] y [2]) El espectro de mioglobina muestra claramente el n / p * y p / p * picos de transición. El hombro entre 180 y 170 nm se piensa que es debido a un p intra-amida / p * transición de transferencia de carga. La longitud de onda más baja de 172 nm se consiguió mediante el uso de una fuente de luz de sincrotrón.

tales transiciones en el UV lejano: un n / p * transición en w220 nm y ap / p * transición en W190 nm. Las características de la señal de CD de un solo cromóforo dependen de los ángulos de torsión locales de la cadena principal del péptido, es decir, la estructura secundaria, y el espectro de CD representa la suma de señales de todos los cromóforos de péptidos en la muestra. En la figura 6.5 la línea continua representa el espectro de CD de la proteína ahelicoidal, la mioglobina. Hay un pico negativo a 222 nm correspondiente a la n / p * de transición y, moviéndose para reducir las longitudes de onda, un pico negativo a 208 nm seguido de un pico positivo a 192 nm. Este último surgen de la p / p * de transición, que genera dos picos en el que el nivel de energía superior se divide (Figura 6.4 derecha) debido al acoplamiento de cromóforos adyacentes a lo largo de secciones de segunda-ary estructura [3]. Hay una transición de transferencia de carga intra-amida adicional [4] que se manifiesta como un hombro a aproximadamente 175 nm en un-helicoidal espectros,

aunque esta información es normalmente sólo obtener-poder mediante el uso de una fuente de luz de sincrotrón. Figura 6.5 también muestra los espectros de CD de la proteína principalmente b hojas (lectina de lenteja) y de una proteína desordenado diseñado para la comparación. Los espectros de las proteínas predominantemente b-hoja tiene p / p * transiciones con magnitudes que son típicamente tres a cinco veces más pequeño que los generados por las proteínas a-helicoidales. estructuras b-hoja también muestran variaciones en la hoja de torsión y la dirección relativa de la B-hebras individuales (paralelos o antiparalelos); en consecuencia, hay grandes variaciones entre diferentes proteínas b-hoja en las posiciones e intensidades de la p acoplado / p * transición. proteínas predo-minantemente desordenadas se caracterizan en gran medida por un solo pico negativo en nm w200. La mayoría de las proteínas contienen una mezcla de tipos de estructura secundaria, y por lo tanto

sus

espectros

son

combinaciones

lineales

de

los

espectros

característicos, ponderados por la proporción de cada tipo de estructura presente.

6.1.1.1.2 UV cercano de CD

Los residuos aromáticos en una proteína (fenilalanina, tirosina y triptófano) tienen carac-carac- p / p * absorciones entre 300 y 250 nm, que se extienden a longitudes de onda más cortas aunque su contribución per-molécula en el UV lejano es pequeño en comparación con el péptido ab-sorción en esta región. Estas absorciones se ven afectados por el medio ambiente local y están allíproa sensibles a la estructura terciaria. Los enlaces disulfuro tienen dos N / S transiciones * que también

6.1 INTRODUCCIÓN

113

dar lugar a un pico de baja magnitud amplio en este rango, o picos separados en función del ángulo diedro del disulfuro [5].

6.1.1.1.3 UNIDADES y ecuaciones

La magnitud de un espectro CD depende de la concentración de la muestra y la longitud

de

trayectoria

celular.

Para

las

comparaciones

espectrales

significativas o análisis cuantitativos de segunda-ary estructura a ser llevadas a cabo, los espectros se deben normalizar a las unidades que eliminan estos factores de la ecuación. En esta sección se discutirá la derivación de estos de la señal de CD prima.

Al igual que en la espectroscopia de absorción, la señal sigue la ley BeereLambert:

donde Al es la absorbancia a una longitud de onda dada, εl es el coeficiente de extinción a que la onda de longitud (M 1 cm 1), c es la concentración molar, y L es la longitud de trayectoria de la célula óptica en cm. Sin embargo, puesto que se trata de la diferencia entre la absorbancia de la izquierda y la derecha CPL, el CD es el equivalente a:

donde L y R se refieren a la luz polarizada izquierda y derecha circular. Por razones históricas, los datos del instrumento se presentan normalmente en unidades de miligrados o elipticidad (q), que se asoció originalmente con

mediciones de dispersión óptica rotatoria y se relaciona con la diferencia en la absorción por:

En términos de la diferencia en los coeficientes de extinción, tenemos elipticidad molar [Q], que tiene unidades de deg / M / cm donde:

Al medir los espectros de la proteína, es conveniente convertir la concentración molar a mg / ml debido a que la señal de CD es dependiente de la cantidad de cromóforos de péptidos en lugar de en el número de moléculas de proteína. Por la misma razón, la elipticidad molar puede ser sustituido por medio elipticidad residuo [q] MRE, que tiene unidades de deg-cm2 d mol / residuo.

En la literatura, por lo general será reportada espectros ya sea en [q] MRE con picos en el orden de 103 a 104 o (como en los espectros mostrados en este capítulo) en unidades de Dεpor residuo, que dan valores que son un factor de 3298 más pequeño. Conversión de unidades de máquina de MDEG a [q] MRE es el siguiente:

donde MRW es el peso residuo medio (peso molecular de la proteína / número de enlaces peptídicos en la proteína), c es la concentración en mg / ml, y L es la longitud de trayectoria óptica en mm.

Tenga en cuenta que el número de enlaces peptídicos ¼ número de residuos1.

6.2 INSTRUMENTACIÓN

Hay una serie de instrumentos de banco superior del CD en el mercado de varios fabri-Turers (ver Secciones Tecnología disponibilidad y lectura adicional). Presentan únicas Spec-ficaciones de competir para obtener una ventaja comercial y proporcionan diferentes formatos de datos, pero todos son capaces de producir tanto de CD como de alta tensión (HT) dsometimes llamados de alto

voltaje

o

dínodo-voltagedmeasurements.

Los

diseños

básicos

de

instrumentos de todos son esencialmente los mismos, con los componentes principales de ser una fuente de luz, un polarizador, un modulador, una cámara de muestra, y un detector (Figura 6.6 arriba).

6.2.1 Configuración general de un instrumento de mesa

La fuente de luz estándar es una lámpara de arco de xenón, que emite una alta y flujo de luz relativamente con-constante desde el infrarrojo, a través de lo visible a las longitudes de onda UV. En el caso de una línea de luz radiación de sincrotrón de dicroísmo circular (SRCD), el diseño es muy similar excepto que el intenso flujo de luz de sincrotrón se utiliza como la fuente de luz [6]. El sistema se purga con nitrógeno para evitar ozono generado-UV de dañar la óptica y esto también permite mediciones por debajo de 200 nm, que de otro modo se evita mediante la absorción de O2. El espectro de CD se mide en toda la gama de

longitud

de

onda

incorpo-rating

las

transiciones

de

interés;

un

monocromador selecciona un ancho de banda estrecho (...