1. Methodes D\' Etudes EN Histologie PDF

Preview

Summary

Download 1. Methodes D' Etudes EN Histologie PDF

Description

METHODES D’ETUDES EN HISTOLOGIE I) INTRODUCTION L’histologie est une discipline qui s’intéresse à l’étude des tissus normaux. Tissu = cellule + MEC. C’est de l’anatomie microscopique et de la physiologie tissulaire(étude de la fonction des tissus). C’est important pour comprendre les maladies, il faut connaître ce qui est normal avant d’étudier l’anormal. L’étude des tissus anormauxest du domaine de la pathologie/anatomie pathologique et cytologie pathologique. Différents types de cellules différenciées déterminent les différents types de tissus élémentaires.    

Tissus épithéliaux: cellule épithéliale Tissus nerveux: neurones + cellules gliales (de soutien) Tissu musculaires: cellules musculaires Tissu conjonctif: groupe hétérogène o Tissus conjonctif commun (majoritairement): ubiquitaire, rôle de soutien avec des fibroblastes, retrouvés le plus souvent à associé à d’autres structures où ils jouent rôle de soutien o Tissus conjonctif spécialisé: tissus adipeux (adipocyte), tissus squelettiques: cartilage, os (ostéocyte), tissus hématopoïétiques: sang (tissus liquide) et tissus lymphoïdes (immunité).

1. Définitions Organes: Entité anatomique macroscopique bien identifiables (ex: foie, poumon, muscles, peau, cerveau). Un organe comporte toujours plusieurs variétés de tissus. Ex: foie, poumon, muscle, peau, cerveau. Viscère: Organe logé dans une des cavités (thorax, abdomen) de l’organisme:  

Viscères creux: qui ont une lumière centraleex: cœur, estomac, intestin Viscère plein: à la coupe ils sont compacts

Système/: ensemble de structure: des cellules, des tissus, des organes qui définissent entre eux des connexions: anatomique, hormonale, communiquent dans un certain but. Ex: SNC, système digestif, système endocrinien diffus ou SED (un tas de cellule disséminées dans plusieurs tissus qui produisent des hormones). La notion de système est transversale et plus complexe à appréhender.

2. Prélèvements Prélèvement de cellules: Toutes ces techniques correspondent à la cytologie qui s’intéresse à la cellule elle-même mais ne s’intéresse pas à la MEC, il n’y a pas d’analyse de l’organisation des cellules les unes par rapport aux autres puisqu’on les sépare:   

Ponction (ou aspiration): prise de sang Frottis: gratter la surface d’un épithélium en général (cellules de surface) Brossage: gratter pour obtenir des cellules plus profondes qu’avec un frottis

Prélèvement de tissus: Permet l’histologie, c'est-à-dire l’analyse des tissus. On étudie à la fois la cellule et la MEC et non plus seulement à la cellule comme en cytologie:   

Biopsie: directe, radioguidée, après endoscopie Chirurgie: biopsie, exérèse (exemple: colectomie) Autopsie: médico-légale ou scientifique

+ Fiche méthode Léo

Apres colorants

3. Outils de l’histologie Œil/: décrire une pièce opératoire, identifier et sélectionner des zones d’intérêt. Il y a un ratio entre le travail et le bénéfice en médecine. On ne peut pas couper tout le prélèvement mais seulement la partie intéressante. Capacité de résolution limitée. Microscope/: permet de rendre visible à l’œil humain ou à un système d’acquisition informatique des structures non visibles à l’œil nu. On a des images agrandies puis on peut séparer les détails de l’image. Pouvoir séparateur ou puissance de résolution: distance minimale séparant 2 points contigus pouvant être reconnus comme étant distincts.

4. Les différents types de microscopes/: Microscopie optique (ou photonique) en lumière directe ou à fond clair +++ Utilise la transmission d’image par les photons. Pouvoir séparateur de l’ordre de 0.2 μm.      

Inversée (regarder des boites en culture) En contraste de phase A fond noir A lumière polarisé A épifluorescence (détecte des substances fluorescentes) + Confocal (association à épifluorescence pour la recherche) +

Microscopie électronique/: utilise la transmission d’image par un flux d’électron. Pouvoir séparateur beaucoup plus important que la MO, 0.2nm, très grosse ≠ d’échelle.  

ME à transmission (utilisé en routine de techniques spécialisé) + A balayage (en recherche pour décrire la structure)

II) METHODES D’ETUDES EN HISTOLOGIE Objectif :   

Connaître le circuit de prise en charge d'un prélèvement histologique humain Connaître en détail les techniques histologiques et cytologiques de routine Connaître les principales techniques spécialisées et leurs principes généraux

Gestion d’un prélèvement tissulaire/: notion d’état frais Lors d'un prélèvement tissulaire, le tissu va perdre ses connexions avec le reste de l’organisme, il n’est pas nourri, pas oxygéné, en état de stress. Dès qu’on enlève le tissu de son support humain: il y a des modifications métabolique, activation de programmes qui entraînent la mort cellulaire (anoxie). Il y a des tissus plus ou moins sensibles, mais le processus de dégradation est toujours commencé. Urgence/!  L’étape pré-analytique (avant l’analyse) conditionne de façon majeure les résultats que l’on pourra obtenir de l’analyse. L’ETAT FRAIS correspond à l’étape pré-analytique au niveau de laquelle il est décidé de ce qui doit être fait (ou ne pas être fait) pour conditionner le prélèvement tissulaire. Etat frais = macroscopie avant fixation/! Situation d’urgence car le prélèvement se dégrade/! (changer) Options/:   

Apposition: obtention de préparations cellulaires Congélation: préservation temporaires Autres types de fixation spécifiques pour techniques hors routine

Standard/: 

FIXATION: immobilisation définitive des constituants tissulaires et cellulaires. La fixation est définitive et irréversible. Elle interdit la réalisation d’options à posteriori. Le prélèvement est fixé pour arrêter la dégradation, on immobilise pour de bon le tissu et ses constituants. Mais avant la fixation il faut décider si on veut faire autre chose avec notre prélèvement: des options.

L’opérateur de l’état frais estle plus souvent le préleveur (médecin, chirurgien) et parfois le médecin pathologiste recevant le prélèvement (si un transport rapide et structuré est possible). Il associe un standard et zéro, une ou plusieurs options sur des zones à identifier. En fonction du contexte, on décide de ce qu’on va faire. L’état frais permet d’anticiper des besoins particuliers et/ou de réaliser des techniques urgentes. Si c’est une grosse pièce on peut sélectionner des fragments d’intérêt pour:   

Faire une empreinte cytologique La réalisation d’un examen extemporané (si indiqué) Sélection pour: o Congélation: petite taille max de 5x5x5mm / fragment o Culture cellulaire ou PDX (recherche) o Autres fixateurs (pour MO) o Fixateur pour ME: 1x1x1 mm maximum / plusieurs fragments o Autres besoins (Ex: culture bactériologique)

1. Les options/à l’état frais a. Appositions pour cytologie Tout prélèvement histologique frais permet également une analyse cytologique après réalisation d’appositions ou d’empreintes sur une lame de verre. Principe: à partir du prélèvement, on sélectionne la pièce du tissu qui nous intéresse pour en prélever une région. La face d’intérêt va être posée sur une lame de verre, ensuite on prend le tissu et on le déconnecte de la lame de verre. Du fait de ce passage transitoire, un certain nombre de cellules vont adhérer à la lame, c’est l’empreinte.

On peut réaliser plusieurs lames de verres avec un prélèvement, cependant elles ne permettent que des études cytologiques. On pourra garder ces tissus pour faire des études histologiques.

Les prélèvements cytologiques ne permettent pas l’analyse de la structure (ou de l’organisation) d’un tissu.

b. Congélation Ce n’est PAS UNE FIXATION, ça permet une préservation du tissu (les cellules ne meurent pas) mais ce phénomène est transitoire, si on arrête la chaîne du froid, les processus enzymatique de dégradation reprennent. On ne préserve le tissu que tant que la chaîne du froid est conservée. La congélation doit être rapide/: moins de 15 minutes pour les ARNm; quelques heures pour l’ADN. On recommande de le faire dans les premières 15 minutes pour une observation fiable du prélèvement, plus on attend, plus on s’éloigne de ce qui se passe in vivo (stress, apoptose tous ces mécanismes entraînent une modification des structures de la cellule, des ARN, des protéines…). Comment congeler ? 

Directement dans de l’azote liquide/: prise très rapide et congélation quasi instantanée. Notamment pour l’ARN, ADN et les protéines. Cependant, c’est très mauvais pour une coupe histologique, on utilise alors l’azote si on ne veut pas observer en microscopie après.



Pour garder une coupe histologique correcte, on utilise un bain d’isopentane refroidi à la glace carbonée ou à l’azote liquide. C’est une technique plus compliquée mais utilisée pour les futures techniques histologiques car elle conserve bien la morphologie en plus de l’ARN, ADN et des protéines.

La congélation conserve moins bien la morphologie que les techniques standards de fixation et d’inclusion. On refroidit dans l’azote liquide ou dans le bain d’isopentane à – 70//80 °C, c’est notamment la température à laquelle l’isopentane commence à former des cristaux pour protéger les cellules de l’azote liquide. Plus c’est froid, mieux c’est. Si pas d’azote ou d’isopentane à disposition : il existe un milieu de préservation des ARN, «/RNA later/», qui permet de stabiliser les ARN et de les adhérer, cela permet de transporter à température ambiante le fragment cellulaire jusqu'à qu’on soit équipés pour la congélation qui sera alors secondaire. Conservation pendant 24h à T ambiante ou 7J à 4°C sans dégradation de l’ARN, ADN, protéines mais la coupe histologique n’est plus possible.

2. La technique standard/: la fixation La fixation doit être faite dès que possible et sert à immobiliser les différents constituants cellulaires et tissulaires. Cela stabilise les tissus et bloque les processus de dégradation, permet de préserver le tissus, prévient la dégradation post mortem. On peut fixer un individu entier dans le fixateur. En histologie le fixateur permet de préparer le tissu pour des techniques histologiques (solvants, milieu d’inclusion) et les colorations ultérieures. Selon le fixateur on pourra faire ou non des techniques spéciales plus tard.

Mécanisme d’action:   

Complexe Dépend du fixateur Ça reste assez mal connu.

Le fixateur va provoquer la précipitation et coagulation des protéines et met en place des liaisons covalentes entre les protéines, les lipides, les ARN pour stabiliser les cellules et la MEC associée. 1er effet: mort cellulaire, c’est irréversible, on ne peut plus remettre en culture. 2e effet: toutes les enzymes sont également mortes, la fixateur bloque toutes les réactions enzymatiques souvent être présente au niveau intra ou extracellulaire, ce qui stabilise le tissu et prévient la dégradation post mortem. Fixateurs simples/: non utilisés en pratique    

Ethanol Acétone Formol (formaldéhyde) Acides: acétique, trichloracétique, picrique (jaune)

Mélange de fixateur ou fixateur simple associé à un tampon: +++ utilisés 

FORMOL NEUTRE TAMPONNE (paraformaldéhyde à 4% + tampon pour garder un pH neutre) : le plus utilisé dans le monde. Garde une morphologie correcte, accès aux ARN et ADN. Compromis acceptable pour autres techniques: hybridation in situ, immunochimie. Meilleur balance coût/bénéfices.



Liquide de Bouin (mélange d’acide picrique, formol, acide acétique, eau): excellente morphologie, mais dégrade les acides nucléiques (pas d’HIS) et provoque auto-fluorescence des tissus. Immunohistochimie limitée. De moins en moins utilisé, remplacé par le formol neutre.



AFAA (mélange d’alcool, de formol, d‘acide acétique): excellente morphologie et immunohistochimie, pas d’auto-fluorescence, acides nucléiques fragmentés.



Autres/: ils ont un intérêt souvent très spécifique, comme pour la ME

Fixation et fixateurs/: Quel fixateur?Décider pendant l’état frais selon les avantages et inconvénient et les besoins.    

Morphologie Immunohistochimie Etudes moléculaires (ADN/ARN) Toxicité

Comment fixer? Immersion dans le fixateur (7 vol. fixateur/1 vol. tissu car si surfixation, on risque d’altérer les techniques faites ensuite)  

En recherche, sur les animaux ou cadavres : perfusion dans les voies cardiaques. Chez l’homme, on rajoute le fixateur dans la bronche: insufflation, on utilise les voies naturelles pour fixer le poumon de l’intérieur puis on plonge dans le fixateur.

Quand? Dès que possible, plus on attend plus la dégradation est avancée Combien de temps? Durée variable de quelques heures à quelques jours. En fonction de:  Type du prélèvement  Volume du prélèvement (7 vol. fixateur/1 vol. tissu)  Nature du fixateur.  Volume du fixateur  Temps optimal/: 24 à 48h pour techniques IHC.

Problème/: le fixateur est liquide, il ne pénètre pas toujours bien dans le solide du prélèvement. Ex: rein, seul la périphérie du rein est fixée et l’interne du rein est toujours en train de se dégrader. Il ne faut pas hésiter à faire des tranches pour que le fixateur pénètre dans l’organe. L’état frais permet préparer la fixation (en faisant des tranches par exemple).

3. Principes de conditionnement On a le prélèvement tissulaire, on décide alors si le transport au laboratoire était nécessaire, rapide ou pas. L’état frais permet de décider d’options/: sélection de fragment pour la fixation, spéciale de la ME, réalisation d’apposition ou de congélation… L’apposition et la congélation sont des techniques d’interprétation rapides, donc compatibles pour un examen extemporané pressé (opérations, en chirurgie). Dans ces cas, il n’est pas possible de faire la technique standard qui met plusieurs heures.

MACROSCOPIE : décrire anatomiquement la pièce opératoire, faire des photos ( iconographie), sélection et identification des fragments d’intérêt. Mais la taille de ce qu’on va étudier dépend de l’équipement. Il existe un équipement standard depuis une 10aine d’année, des cassettes plastiques utilisées pour la sélection, tranches de tissus qui font au max le contenu de la cassette: 30x20x3mm au max. On échantillonne notre pièce. On peut faire artisanalement des choses plus grandes mais très complexes et couteuses. La cassette plastique accompagne le prélèvement sur tout son trajet. Sur sa tranche, on note les informations indispensables sur le tissu. NB: il existe aussi des «grandes cassettes»: 75x50x15mm au max.

DECALCIFICATION: toujours après fixation. C’est obligatoire pour les tissus durs avec des cristaux de calcium. Ex: biopsie ostéo médullaire BOM (os iliaque), prélèvement osseux, dent + cristaux inattendus, anormaux. Si on ne décalcifie pas, on abime le matériel (rasoir) et on ne peut pas bien couper. Etape proscrite si le tissu n’est pas calcifié car elle devient nuisible pour les examens futurs/! Principe : le tissu dans la cassette plastique est trempé dans un liquide chélateur de Ca++ qui permet de faire disparaitre les cristaux de Ca++, ça peut être accéléré avec la chaleur et l’électrolyse.

INCLUSION/: fondamentale car elle permet de transformer quelque chose de mou en un tissu à consistance ferme permettant la coupe et l’étude. Milieux d’inclusion: on utilise la paraffine qui fond à 56°C et qui est solide à température ambiante. 1. Etape/automatisée en 3 étapes dans des bacs en quelques heures. Exemple: automates d’inclusion en paraffine   

Déshydratation: bains d’alcool successifs qui permettent de faire sortir le fixateur du prélèvement (et de l’eau) Clarification/: bain de substances toxiques: solvants toluènes ou xylène, on élimine l’éthanol et on prépare le tissus à la 3ème étape Imprégnation: paraffine liquide 57° qui va imprégner le tissu dans la cassette

2. Etape manuelle/: ENROBAGE Le tissu a été modifié par étape A. Pour l’enrobage, on prend la pièce d’intérêt dans la cassette et on le met au contact d’une cupule métallique, on y verse de la paraffine chaude qui va combler la cupule métallique et va déborder dans le support plastique via les orifices (cassette inversée). On refroidit (4°C) le sandwich = parrafine liquide + pièce + support; pour solidifier la paraffine, on obtient un support plastique sur une face et le tissu sur l’autre face enrobé dans la paraffine. 3. Etape manuelle/: DEMOULAGE Séparation mécanique: on démoule la cupule métallique de la paraffine, on obtient le tissu dans la paraffine et adhérant au support plastique de la cassette. La cupule métallique est réutilisable. COUPE/: on utilise le microtome, appareil très lourd et très stable pour avoir des coupes très fines. Système permettant l’incrémentation modulable du bloc par rapport au rasoir. Le rasoir va faire des a/r sur le bloc, l’incrémentation rapproche le rasoir du bloc et permet de régler la distance que le rasoir va faire à rapport au bloc à chaque tour de manivelle. A chaque tour de manivelle, le rasoir va faire une tranche entre 3 à 5μm d’épaisseur (dépend selon le tissus, il faut quelque chose de très fin en gardant la qualité). Ainsi on peut faire plusieurs coupes ce qui donne un ruban de paraffine qu’on peut récupérer ensuite. L’avantage de la paraffineest que l’on peut manipuler des coupes très fines. Après on récupère la coupe à la pince, on l’étale sur lame de verre, bain marie à 37° pour déplisser la coupe puis on récupère la coupe sur lame de verre. Séchage sur platine chauffante, paraffine va adhérer au verre et ainsi on a quelque chose de stable. COLORATION/: les tissus ne sont généralement pas colorés naturellement sauf quelques pigments naturels:    

Mélanine Hémosidérine (amas de ferrique) Lipofuschines, ce sont des pigments bruns/noir. + Pigments exogène(encre) : peau tatouée.

Les tissus non colorés doivent être colorés pour être observés. 1. Déparaffinage/: Il faut d’abord déparaffiner car la paraffine est imperméable. Il faut tremper la lame dans des bains de solvant toluène-xylène, ce qui enlève la paraffine sans enlever le tissu. 2. Ré-hydratation: bains d’alcool de moins en moins concentrés pour réhydrater les lames. 3. Colorants/: colorer, plusieurs recettes de colorant ce qui permet de faire tous les colorant qu’on veut. Le plus utiliséest HES/: bains d’hématéine/eau/bain d’éosine/eau/bain safran/eau. Ce sont des bains successifs manuels ou automatisés. 4. Dé-hydratation: ensuite il faut déshydrater la coupe avec des bains d’alcool de plus en plus concentrés. 5. Montage: colle + lamelle. La prise de la colle se fait sur lame horizontale, à température ambiante.

OBSERVATION – INTERPRETATION/: observation notamment au microscope photonique. Une bonne observation va être possible avec la coloration HES qui est celle standard en France. C’est une coloration trichrome/:   

Hématéine: colorant bleuté basique se fixant sur les acides (ou structures basophiles). Exemples : acides nucléique, polyribosome. Eosine: colorant rouge acide se fixant sur les bases (ou structures acidophiles). Exemples : protéines couleur rosée. Safran: sur les fibres de collagène couleur jaune.

III) METHODES D’ETUDE EN HISTOLOGIE/: CAS PARTICULIERS 1. Option/: gestion d’un prélèvement tissulaire congelé Etat frais/: sélection de zones d’intérêt pour:   

Empreintes cytologiques Congélation (conservation à -80°C maximum) Congélation suivie de coupe sur un examen extemporané

Coupes de tissus congelés: Une fois congelé, on pourra faire l’observation du prélèvement congelé. On peut faire une coupe du tissu congelé si on effectue un réchauffement relatif: de – 80°C à – 30/20°C pour rendre le tissu suffisamment mou (si trop dur risque d’abîmer le rasoir). Puis on fixe le tissu par enrobage, on utilise de la colle OCT pour rendre le tissu adhérent...