5 - double hybride - Note du professeur PDF

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Note du professeur...

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Mise en évidence d’interactions protéine/protéine système 2 hybrides I/ Métabolisme du galactose chez Saccharomyces cerevisiae - Régulation des gènes GAL II/ L’activateur Gal4 1. UASG/UASGal 2. La protéine Gal4 se fixe à l’ADN 3. Domaines fonctionnels de Gal4 - DNA binding domain : BD - Mise en évidence d’un domaine d’activation : AD

III/ Construction d’activateurs de transcription de levure dépourvus de séquences de levure

IV/ Développement du système 2 hybrides par Stanley Fields à partir des propriétés de l’activateur Gal4

Régulation de la transcription chez les Eucaryotes

Métabolisme du galactose chez Saccharomyces cerevisiae

Voie Leloir

L’ ’expression des gènes GAL est induite par le galactose GAL2, GAL1, GAL7, GAL5 è฀ gènes métaboliques GAL3, GAL4, GAL80 è฀ gènes régulateurs

Régulation des gènes GAL chez S. cerevisiae L’activateur+ de+ transcription+ Gal4+ est+ toujours+ 5ixé+ au+ promoteur+ des+ gènes+ GAL,+ aussi+ bien+ en+ absence+ qu’en+ présence+de+galactose.+ +

- galactose

+ galactose

Gal4p = Activateur

Régulation des gènes GAL chez S. cerevisiae

- galactose

+ galactose

L’activateur+ de+ transcription+ Gal4+ est+ toujours+ 5ixé+ au+ promoteur+ des+ gènes+ GAL,+ aussi+ bien+ en+ absence+ qu’en+ présence+de+galactose.+ + (A)$En+absence+de+galactose,+le+domaine+ d’activation+ de+ Gal4+ est+ masqué+ par+ Gal80,+ce+qui+empêche+le+recrutement+de+ la+machinerie+de+transcription.+ +

Gal4p = Activateur

En absence de galactose, Gal80p se fixe sur Gal4p et inhibe son action d’activation des gènes GAL

Régulation des gènes GAL chez S. cerevisiae

- galactose

+ galactose

L’activateur+ de+ transcription+ Gal4+ est+ toujours+ 5ixé+ au+ promoteur+ des+ gènes+ GAL,+ aussi+ bien+ en+ absence+ qu’en+ présence+de+galactose.+ + (A)$En+absence+de+galactose,+le+domaine+ d’activation+ de+ Gal4+ est+ masqué+ par+ Gal80,+ce+qui+empêche+le+recrutement+de+ la+machinerie+de+transcription.+ + (B)+En+présence+de+galactose+l’inhibition+ exercée+ par+ Gal80+ est+ levée+ par+ un+ mécanisme+ impliquant+ une+ interaction+ directe+ avec+ la+ protéine+ Gal3+ qui+ est+ un+ «+ senseur+ »+ de+ galactose+ intracellulaire.+ La+ 5ixation+ de+ galactose+ (losange)+ et+ d’ATP+(triangle)+par+Gal3+permet+à+cette+ dernière+d’+interagir+avec+Gal80+(dans+le+ noyau+ ou+ dans+ le+ cytoplasme).+ Ce+ «+ déplacement+ »+ de+ Gal80,+ permet+ à+ l’ activateur+ Gal4+ d e+ recruter+ la+ machinerie+de+transcription.

Gal4p = Activateur

En absence de galactose, Gal80p se fixe sur Gal4p et inhibe son action d’activation des gènes GAL

En présence de galactose, Gal3p fixe le galactose et interagit avec Gal80 pour lever l’inhibition de Gal4p è฀ activation des gènes GAL

UASG/UASGal GAL10

GAL1

UASG/UASGal GAL10

GAL1

Localisation des UASG dans les promoteurs des gènes GAL auxquelles se fixe Gal4

UASG/UASGal GAL10

GAL1

Localisation des UASG dans les promoteurs des gènes GAL auxquelles se fixe Gal4

Un oligonucléotide de 17pb similaire à l’UASG placé en amont du promoteur minimal d’un gène confère à ce gène une expression GAL4-dépendante

UASG/UASGal GAL10

GAL1

Localisation des UASG dans les promoteurs des gènes GAL auxquelles se fixe Gal4

Un oligonucléotide de 17pb similaire à l’UASG placé en amont du promoteur minimal d’un gène confère à ce gène une expression GAL4-dépendante L’ ’UASG est un module dont le seul rôle est d’amener Gal4 au niveau d’un promoteur

Le gène GAL4 code pour une protéine de 881 acides aminés qui se fixe à l’ADN (UASG) DNA-binding domaine de Gal4 mis en évidence par des tests in vitro confirmés in vivo

La région (1-74) de Gal4 possède le BD qui se fixe à l’UASG

Domaine de fixation à l’ADN (BD) de Gal4

Mise en évidence de l’existence d’un domaine d’activation (AD) Construction de gènes hybrides GAL4-lacZ

Protéines de fusion exprimées dans une souche Δ gal4 Gal-) 1. Gal4(1-74)-β βGal 2. Gal4(1-147)-β βGal 3. Gal4(1-753)-β βGal 4. Gal4(1-848)-β βGal

Seule la construction 4, Gal4(1-848)-βGal est capable de complémenter la mutation Δgal4

Les protéines de fusion 1, 2 et 3, qui contiennent différentes régions N-terminales de Gal4 et qui se fixent à l’ADN sont incapables d’activer la transcription

Mise en évidence de l’existence d’un domaine d’activation Construction d’un gène hybride lexA-GAL4∆DNA BD Souches Δ gal4 contenant différents gènes reporters lacZ lacZ no UAS

lexA-Gal4 881

lacZ UASG

lacZ lexAop

Le seul rôle du BD est d’ancrer correctement l’AD

Localisation du domaine d’activation de Gal4 (AD) Expériences de délétions de GAL4

Constructions, contenant toutes BD, transformées dans une souche his3 Δgal4 pGAL1-lacZ

2 régions AD

Localisation du domaine d’activation de Gal4 (AD) Expériences de délétions de GAL4

Constructions, contenant toutes BD, transformées dans une souche his3 Δgal4 pGAL1-lacZ

2 régions AD

Seule nécessité pour AD : être un domaine acide

Profil d’hydrophobicité de Gal4

Isolement de « AD » à partir du génome d’ E. coli

Ligation, etc Construction d’ ’une « banque » Digestion vecteur avec l’ ’enzyme BamHI

Digestion ADN E.coli avec l’ ’enzyme Sau3A

Transformation d’ ’une souche de levure his3 Δgal4 pGAL1-lacZ 15000 clones His+ parmi lesquels 154 donnent une coloration bleu sur Xgal

Isolement de « AD » à partir du génome d’ E. coli

Extraction de 35 de ces plasmides et séquençage de l’ADN E. coli cloné pour 15 d’ ’entre eux : Les inserts ont des tailles de 79 à 245pb correspondant à des phases codantes de 12 à 81 aa Ces polypeptides sont tous différents mais possèdent tous une charge négative Ces polypeptides fonctionnent comme des « AD » chez la levure

Ces « nouveaux activateurs » sont également capables de restaurer le phénotype Gal+ d’ ’un mutant Δgal4 : ils activent tous les gènes GAL

Construction d’activateurs de transcription de levure dépourvus de séquences de levure

Transformé dans une souche Δgal4 lexAop-lacZ

lacZ lexAop

Développement du système 2 hybrides par Stanley Fields à partir des propriétés de l’activateur Gal4 Basé sur la nature modulaire des activateurs de transcription (AT) : . il y a 2 domaines fonctionnels différents : BD et AD . des activateurs hybrides peuvent être construits . BD et AD peuvent être portés par 2 protéines différentes interagissant Le système 2 hybrides consiste à reconstituer un AT en rapprochant BD et AD par le biais d’une interaction protéine/protéine 3 éléments sont nécessaires : . Une protéine « X » fusionnée à un BD : »appât »

X BD Y AD

. Une autre protéine « Y » fusionnée à un AD : « proie »

ou

Y

AD

. Un gène reporter dont l’activation transcriptionnelle par l’activateur reconstitué signalera l’interaction des protéines « X » et « Y »

X BD

Y

Y AD reporter

activation du reporter si interaction

X ou bien

BD

AD

reporter

pas d’ ’activation du reporter si pas d’ ’interaction

Développement du système 2 hybrides par Stanley Fields à partir des propriétés de l’activateur Gal4 1. Systèmes de 2 plasmides réplicatifs multicopies pour réaliser les fusions avec BD et AD MCS

ter HIS3

BD

MCS

ter TRP1

AD

Ori 2µ µ

Ori 2µ µ

Les domaines BD (1-147 Gal4) et AD (768-881 Gal4) sont N-terminaux dans les fusions Les promoteurs sont forts (pADH1 pour 1ier système) Signal de localisation nucléaire pour les 2 fusions

2. Souches de levures qui contiennent au moins 1 gène reporter : pGAL1-lacZ UASG (pour Gal4) génotype min (pour l’exemple) his3 trp1 Δ gal4 Δgal80 3. Le test nécessite la co-expression des 2 protéines de fusion dans 1 seule cellule : les 2 plasmides sont co-transformés 4. Après co-expression des protéines de fusion l’activité du(des) gène(s) reporter(s) est testée

Autre système 2 hybride: LexA-B42 1. Systèmes de 2 plasmides réplicatifs multicopies pour réaliser les fusions avec BD et AD MCS

ter BD LexA

Ori 2µ µ

HIS3

MCS

ter AD B42

TRP1

Ori 2µ µ

Les domaines BD LexA et AD B42 sont N-terminaux dans les fusions Le promoteur de BD Lex A est fort (pADH1), le promoteur de AD B42 est inductible (par gal) Signal de localisation nucléaire pour la fusion B42 + épitope HA

Double hybride: interaction et activation! •  Dans le noyau, l’appât (X-BD) se fixe aux séquences régulatrices du promoteurs du gène rapporteur! •  Si X interagit avec Y, la protéine Y-AD se retrouve au voisinage du promoteur du rapporteur ! •  Le domaine d’activation (AD) l’ ’expression du gène rapporteur!

Si rapporteur = gène LEU2, test croissance sur milieu sans Leucine ?!

active

Activation du gène rapporteur LacZ!

Application Double hybride

Dissection moléculaire de la voie de signalisation Hedgehog chez la Drosophile 4 états: embryon, larve, pupe, adulte

Voie intervenant dans des étapes cruciales du développement des vertébrés et des insectes et de leur morphogénèse: Drosophile, symétrie droite/gauche des vertébrés, tube neural! Induit la différentiation et la prolifération cellulaire! Impliquée dans certains cancers: peau, intestin, système nerveux!

La voie hedgehog La molécule signal Hedgehog est reconnue et captée à la surface cellulaire par un complexe membranaire: récepteur Ce récepteur est composée des protéines membranaires Smo et Patch. La liaison de Hedgehog au récepteur Sma/Patch induit une cascade de signalisation intracellulaire aboutissant à la régulation de facteurs de transcription: le facteur Ci Sans signal, Ci est protéolysé et agit comme represseur dans le noyau En présence du signal Hh, Ci n’est pas protéolysé et agit comme un activateur dans le noyau 4 protéines impliquées dans la transduction du signal: Ci, Cos2, Fu, SuFu => associées en complexe ?

Validation interaction Sufu/Fu par 2-hybride Appât: fusion LexA-SuFu! Proie: Fusions entre B42 et certains parties de Fu! Contrôle +: Rab3/GGTII! ! 1! !

Kinase!

domaine régulateur! 306!

805!

Gènes rapporteurs: LEU2 et LacZ! ! ! ! !

+ X-Gal!

- Leu!

Validation interaction Sufu/Ci par 2-hybride/GST Pull-down/CoIP Appât: fusion LexA-SuFu! Proie: Fusions entre B42 et certaines parties de Ci! Doigts Zn! 1! !

346!

Gènes rapporteurs: LEU2 et LacZ! ! ! ! ! !

- Leu! + X-Gal!

Validation complexe Sufu/Fu/Ci -  Pas d’interaction 2-hybride entre Fu et Ci! => Hypothèse ?! -  Coimmunoprécipitation Ci-Fu et SuFu-Ci => Hypothèse ?!

Expression simultanée de 3 plasmides dans la levure:! pEG202: fusion LexA! pJG4-5: fusion B42 ! pYEF2: SuFu ou non! ! Gène rapporteur LEU2! - Leu!

Interaction Cos2/Fu

+ X-Gal!

- Leu!

! Kinase! 1!

domaine régulateur! 306!

Fu!

805!

1!

liaison µtubule s! 538!

Coil-coiled! 751!

Cos2!

1201!

Interaction Cos2/Ci par 2-hybride

! Doigts Zn! 1!

703!

430!

Ci!

1!

liaison µtubule s! 538!

Coil-coiled! 751!

Cos2!

1201!

Voie Hedgehog chez la drosophile Résumé des interactions et modèle

Double hybride: Avantages •  Pas besoin d’être un grand biochimiste car pas besoin de purification! •  Rapide et peu onéreux! •  Nombreux plasmides/souches disponibles! •  système hétérologue possible! •  Système sensible: détection interaction kinase-substrat !

•  Utilisation de protéines de fusions => fonctionnelles, stables?! •  Protéines surexprimées => loin de la réalité physiologique! •  Nombreux artéfacts possibles (protéines collantes, séquences activatrices)! •  Résultats à confirmer par d’autres approches! •  lieu de l’interaction: noyau => pas adaptés pour les protéines membranaires !

Double hybride: adaptation aux protéines membranaires

UBPs (Ubiquitin specific protease)!

Double hybride membranaire: Split Ubiquitin System La fusion entre Ubiquitine et une protéine cible est reconnue par UBPs après le motif Gly-Gly-X, situé à l’extrémité C-terminus de l’ubiquitine. A l’inverse d’autres protéases, les UBPs ne reconnaissent pas un site de coupure spécifique mais reconnaissent l’ubiquitine repliée correctement.

Double hybride membranaire: Split Ubiquitin System La fusion entre Ubiquitine et une protéine cible est reconnue par UBPs après le motif Gly-Gly-X, situé à l’extrémité C-terminus de l’ubiquitine. A l’inverse d’autres protéases, les UBPs ne reconnaissent pas un site de coupure spécifique mais reconnaissent l’ubiquitine repliée correctement. Ubiquitine peut être exprimée dans la levure en 2 domaines séparés: une partie N-terminale (Nub) et une partie Cterminale (Cub). Les 2 moitiés conservent de l’affinité l’une pour l’autre et peuvent se réassocier spontannément Ubiquitine recomposée:

Double hybride membranaire: Split Ubiquitin System La fusion entre Ubiquitine et une protéine cible est reconnue par UBPs après le motif Gly-Gly-X, situé à l’extrémité C-terminus de l’ubiquitine. A l’inverse d’autres protéases, les UBPs ne reconnaissent pas un site de coupure spécifique mais reconnaissent l’ubiquitine repliée correctement. Ubiquitine peut être exprimée dans la levure en 2 domaines séparés: une partie N-terminale (Nub) et une partie Cterminale (Cub). Les 2 moitiés conservent de l’affinité l’une pour l’autre et peuvent se réassocier spontannément Ubiquitine recomposée: “Split Ubiquitin”. Si les parties Nub et Cub sont coexprimées dans une cellule, la proteine cible fusionnée à Cub sera clivée du fait de la réassociation Nub-Cub en SplitUbiquitin.

Double hybride membranaire: Split Ubiquitin System Une mutation ponctuelle (Ile13Gly) dans la moitié N-terminale NubG abolit complètement l’affinité entre les 2 moitiés et la réassociation spontanée Nub-Cub. Pas de reconnaissance par UBPs et la protéine cible n’est pas clivée.

Double hybride membranaire: Split Ubiquitin System Une mutation ponctuelle (Ile13Gly) dans la moitié N-terminale NubG abolit complètement l’affinité entre les 2 moitiés et la réassociation spontanée Nub-Cub. Pas de reconnaissance par UBPs et la protéine cible n’est pas clivée.

La protéine appât est fusionnée au domaine Cub suivi d’une protéine rapporteur. La protéine “proie” est fusionnée au domaine NubG domain. Si les 2 protéines interagissent, cette interaction rapproche les parties NubG et Cub suffisamment pour p e r m e ttr e l e u r r é a s s o c i a ti o n . U B P s reconnaissent Split-Ubiquitine et libèrent par clivage la protéine rapporteur (rouge).

Double hybride membranaire: l’appât Dépendance de la topologie de la protéine membranaire!

LexA-VP16: fusion entre domaine BD de LexA et domaine AD de VP16!

Site de clivage du côté C-term de Cub!

Clivage par UBPs!

Libération de LexAVP16!

Double hybride membranaire: principe

L’interaction de l’appat et de la proie reconstitue le module Ub = clivage et libération de LexA-VP16 => migration dans le noyau => activation de gènes rapporteurs (LacZ et gènes métaboliques (HIS3, ADE2...)

La voie de signalisation glucose chez la levure K. lactis

glucose senseurs de glucose

Rag4

Rag4 C C

C C

Rag8

Rag8 caséine kinase I

Sms1

P! P! P!

Ub

P

co-répresseur

Rgt1 Rgt1 répresseur

RAG1 gène de perméase glucose

RAG1

Sms1 interagit avec le senseur Rag4 et le répresseur KlRgt1

Interaction Sms1/ Rag4

Rag4-CubPLV

Rapporteurs ADE2, HIS3

Rapporteur lacZ Activité β-Gal, U ± SD Rag4-CubPLV

NubG-X Contrôle négatif NubG-Sms1 0 Met

NubG-X

0.3 ± 0.1

NubG-Sms1

6,5 ± 0.5

2mM Met Interaction Sms1/ KlRgt1

Rapporteur lacZ B42

B42-Sms1 galactos e

glucose

LexA-KlRgt1

LexA-KlRgt1

Rapporteur LEU2

B42 B42-Sms1 galactose

glucose...