Title | Cours 6 - Note du professeur |
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Course | Microbiologie 2 |
Institution | Université Claude-Bernard-Lyon-I |
Pages | 31 |
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Note du professeur...
5'Communica4on'intercellulaire'et'virulence' Notion de quorum sensing: communication entre les cellules/comportement collectif Faible'densité'bactérienne'
Gène%de%virulence% autoinducteur% Protéine%R%;%ac4vateur%
Forte'densité'bactérienne'
Un signal quorum sensing - Molécules dont la synthèse a lieu pendant une phase spécifique du développement bactérien Ou répond à un changement de conditions environnementales - Accumulation dans le milieu - molécules reconnues par un récepteur spécifique bactérien - l’accumulation de la molécule induit une modification physiologique de la bactérie - Modification qui concerne l’ensemble de la population - Gram négatives: molécules de type acyl-homosérinelactone - Gram positives: petits peptides (5 à 17 AA)
Communication intercellulaire système luxI/luxR
Découverte d’un système d’autoinducteur chez Vibrio fisheri (1979) impliqué dans l’émission de lumière. structure des AHL (acyl-homosérinelactone) différentes pour chaque espèce Plus de 70 espèces de gram négative utilisent le système LixI/LixR
Un langage chimique complexe LuxS AHL-2 synthétase : Un second système producteur d’AI
Une souche peut produire plusieurs molécules différentes
LuxI AHL synthétase
D’après%Pereira%et%al,%FEMS%Microbio%reviews%2012%
D’après%Pereira%et%al,%FEMS%Microbio%reviews%2012%
Un mécanisme de communication très répandu …
D’après%Grandclément%et%al,%FEMS%Microbio%reviews,%2015%
Les différents phénotypes contrôlés par le quroum sensing
D’après Diggle, Current Biol vol 17no21
Quatre grandes fonctions contrôlées par le quroum sensing
1. Maintenance de la cellule et prolifération (enzymes sécrétées, sidérophores, sporulation..) 2. Comportement de la cellule (formation biofilm, dispersion,mobilité) 3. Transfer (horizontaux ) de gènes (conjugaison..) 4. Interactions avec un hôte ou autres microbes (facteurs de virulence, antibiotiques…)
Une réponse au Quorum sensing:dégradation des autoinducteurs
ex:la production de lactonases, Amidases… %
D’après%Grandclément%et%al,%FEMS%Microbio%reviews,%2015%
Exemple'de'Pseudomonas'aeruginosa' Molécules QS molécules de signalisation pour la bactérie * Production de facteurs de virulence (élastase, protéases, pyocine.. • * Chélation et transport du fer * Mobilité * Formation du biofilm * Résistance aux UV, dessication, agents antibactériens (pompes a efflux) *Autolyse (contrôle de la population) *adhésion (répression des gènes codant les adhésines) (contrôle du passage phase de colonisation /phase invasion) (ex Staphylococcus aureus)
Exemple'de'Pseudomonas'aeruginosa' Interactions avec les autres populations microbiennes
Partageant le même environnement: Gram positive: Staphylococcus aureus Inhibition de la mise en place du système QS de S.aureus Inhibition de la croissance (colonies plus petites , plus résistantes aux atb) Flore fongique: Candida albicans (levure pathogène opportuniste) • Suppression de la croissance filamenteuse (à très forte concentration de molécules QS) • Suppression de la production de certaines molécules QS de Pseudomonas par Candida: inhibition du biofilm sur les hyphes
Molécules QS Effets sur l’hôte Effet immunomodulateur Immunosuppresseur (à faible concentration) Proinflammatoire Apoptose Effets cardiovasculaires (dilatation)
QS:'un'élément'important'de'la'stratégie'infec4euse' ' Une'cible'à'exploiter'dans'la'lu?e'an4microbienne'
Vers la recherche de molécules QSI (Quorum Sensing Inhibitor)
Inhibition de la synthèse des autoinducteurs, Dégradation des autoinducteurs, Blocage
des récepteurs des autoinducteurs……
D’après%Grandclément%et%al,%FEMS%Microbio%reviews,%2015%
Effets d’extraits de plantes Sur la production de violaceine produite par Chromobacterium Violaceum (dépendante du QS)
D’après%Grandclément%et%al,%FEMS%Microbio%reviews,%2015%
Apport de la génomique en infectiologie Génomes microbiens
SEQUENCAGE
(génopôles)
Données génomiques ANNOTATION%
Les outils indispensables Les génomes séquencés et annotés Différentes technologies: La transcriptomique/ARN séquençage La protéomique
GENOMIQUE FONCTIONNELLE%
La métabolomique La métagénomique La validation des données (création de mutants)
Génomes bactériens séquençés (8500)
Mais aussi………………………
Génomes levures séquençés
Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans…. Génomes fongiques séquençés
Aspergillus fumigatus Penicillium chrysogenum Botryis cinerea ….. Génomes parasites séquençés
Plasmodium falciparum Entamaeba histolytica Leishmania…%
Approche'transcriptomique' Fabrication d’une micropuce à ADN
Culture d’expression En conditions A et B
Extraction ARNm' Synthèse ADNc: Incorporation de nucléotides fluorescents' Hybridation%
Détection fluorescence% L’ADNc fluorescent s’hybride au niveau du gène correspondant% Superposition des images% D’après Perry, Staley, Lory «!Microbiologie!»%
Séquençage ARN (séquençage à haut débit NGS)
Extraction ARN m Fragmentation chimique Synthèse de CDNA Enrichissement par PCR (création de banques) Séquençage à haut débit (NGS)
Approche'protéomique/ sécrétome'
Extraction Protéines Intracellulaires ou sécrétées
Mise en culture'
Séparation Protéines Par Électrophorèse bidimensionnelle Point isoelectrique/PM'
Identification directe'
Séquence AA'
Prélèvements Identification des spots Par digestion trypsique Suivie de spectrométrie de masse (LC/MS-MS)
% Géne'
Exemple: utilisation de la transcriptomique pour comprendre les modifications de l’expression génique lors de la mise en place de la stratégie infectieuse d’E coli entérotoxinogène
2013%
1. Contact%bactérie%et%culture%de%cellule%épithéliales% 2. Sépara4on%bactéries%ayant%adhéré/bactéries%planctoniques% (dans%le%milieu%de%culture)%% 3.%taux%expression%sup%à%2%(pvalue%0.05)% % Lors%de%l’adhésion,%% peu%de%gènes%sur%exprimés%%en%comparaison%des% Gènes%sous%exprimés%
Niveau%expression%
Bilan%de%l’expression%de%gènes%:% Tles%gènes%les%plus%exprimés%lors%de%l’adhésion% Sont%impliqués%dans% Adhésion%(voir%diapo%suivante)% Mobilité% Produc4on%de%2%toxines%(eltA,%STTH)% (Toxine%thermolabile%LT,%et%une%thermostable%)% Métabolisme%cTdiTGMP%(régula4on)% % % T de%fonc4on%inconnue%sous%exprimés%% T MAIS%sur%exprimés%dans%la%cellule%
(sur%% cellules)%
(Dans% milieu)%
(Après%lyse%% des%cellules)%
Expression des gènes codant pour différentes adhésines lors de l’interaction avec les cellules épithéliales:
5%répé44ons%
Expression modulée qui varie après 15 et 60 min de contact bactéries/cellules
fliC%code%pour%la%flagelline% Adhésion% 30%60%120%min%de%contact%
15%
%30%%%%%%%%%%60%min % % %%
%
Etude de l’expression de gènes codant pour des protéines immunoréactives
Lors du contact bactéries/ cellules répression des gènes : une stratégie pour échapper au système immunitaire de l’hôte? Vers une stratégie vaccinale????
Approche'métagénomique'
Faire un catalogue de tous Les microorganismes, cultivables ou non, Les gènes , les métabolites produits Dans un territoire donné
Nombre d’espèces identifiés dans le tractus digestif
Plus de 1000 espèces décrites Plus de 3 millions de gènes décrits
1 Isolement des premières espèces: Mise au point de milieux de culture Techniques d’observation.. 2 Culture de bactéries anaérobies: amélioration des techniques de mise en culture
D’après%Rajilic,%FEMS%Microbiolgy%reviews,2014%
3 Apport de la biologie moléculaire/ Séquençage des génomes
Approche'métagénomique' Métagénome intestinal humain:
Extraction ADN total
amplification PCR «!ARN16S!»
Séquencage Haut débit
100 000 milliards d’espèces des centaines d’espèces différentes Seules 30% max cultivables 19 000 fonctions identifiées
clonage: banque métagénomique
Séquence ADN ITS% Criblage d’activités…%
Recherche Criblage de molécules de nouvelles molécules% «!anti-microbienne!»%
Banques de données% Identification Et/ou phylogénie%
lien entre population et certains dérèglements (obésité)/maladies (chroniques, inflammatoire du tube digestif)?'
Métagénome intestinal humain projet européén; plus de 400 individus étudiés%
Criblage d’activités…%
Fécès% - - - - - -
Iléon%
Les%prébio4ques% oligosaccharides%ou%des%polysaccharides%à%courte%chaîne% cons4tués%approxima4vement%de%deux%à%vingt%unités%de% sucre.,%non%dégradés%dans%l’intes4n%grêle,%substrats%pour% bactéries%présentent%dans%gros%intes4n.%
Extraction ADN total Fragments 30 à 40kb clonés dans des vecteurs de type Fosmides dans E coli obtention de clones bactériens (156000 fécès/20000 iléon) clones cultivés sur différents substrats (prébiotiques) Criblage d’activité sur différents substrats Extraction et séquençage de l’ADN
Mise%en%évidence%de%gènes%codant%pour%des%ac4vités%responsable%de%la%dégrada4on%de%prébio4ques% (Même%si%la%souche%n’est%pas%connue%ou%non%cul4vable)%%
Approche'métagénomique'
Métagénomique buccale
73%des séquences codent pour des protéines 51% : protéines de fonctions connues 3%: protéines impliquées dans la résistance aux ATB et composés toxiques La bouche : un réservoir pour les bactéries résistantes?
D’après%Xie%et%al,%2010%...