6-Efecto de los Inhibidores en la cadena respiratoria PDF

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Informe de Bioquímica 2do semestre....

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EFECTO DE LOS INHIBIDORES EN LA CADENA RESPIRATORIA

INTRODUCCIÓN En este trabajo se tocará el tema de inhibidores en la cadena respiratoria. Se entiende por inhibidor, que un compuesto que impide que alguna, o algunas, enzimas catalicen. Este tipo de compuestos son específicos, o sea que pueden inhibir a un grupo de enzimas, pero no tener ninguna actividad con otras enzimas. (Martínez, 2016). Según Villalobos (2017) si un inhibidor es competitivo, disminuirá la velocidad de reacción cuando no hay mucho sustrato, pero si hay mucho sustrato, este "ganará". Es decir, la enzima de cualquier forma puede alcanzar la velocidad máxima de reacción siempre que haya suficiente sustrato. En ese caso, casi todos los sitios activos de casi todas las moléculas de enzima estarán ocupadas por el sustrato en lugar del inhibidor. Si un inhibidor es no competitivo, la reacción catalizada por la enzima jamás llegará a su velocidad de reacción máxima normal, incluso en presencia de mucho sustrato. Esto se debe a que las moléculas de enzima que están unidas al inhibidor no competitivo están "envenenadas" y no pueden hacer su función, independientemente de la cantidad disponible de sustrato. (Villalobos, 2017) Actúan a nivel del complejo I (NADH-ubiquinona reductasa): rotenona, producto vegetal, poderoso veneno de peces, amital y otros barbitúricos, y anestésicos como halotano. Estas sustancias impiden la llegada a la CoQ de hidrógenos procedentes de sustratos oxidados por deshidrogenasas ligadas a NAD. No afectan, en cambio, la oxidación de succinato y otros sustratos que ceden hidrógenos a flavoproteínas con FAD, probando así que éstos siguen otra vía. El antibiótico antimicina A inhibe el transporte de electrones en el complejo III. Cianuros (CN), monóxido de carbono (CO) y azidas (N3-) inhiben específicamente la citocromo-oxidasa o complejo IV y bloquean la etapa final de activación del oxígeno. (Blanco, 2001) El uso de inhibidores no sólo ha ayudado a deducir la secuencia de la cadena respiratoria, sino que ha permitido conocer mejor el mecanismo de acción de algunos fármacos y venenos.

1

OBJETIVO 

Demostrar el efecto de algunos inhibidores sobre la cadena respiratoria con el objetivo final de identificar sus componentes, empleando para ello enzimas de homogeneizado hepáticos.

MATERIAL Y MÉTODOS 1. Material biológico: 

Homogenizado hepático

2. Material y equipo de laboratorio: 

Gradillas para tubos



Tubos de ensayo de 13 x 100 mm



Pipetas de vidrio de 1,2 y 5 mL



Mortero

3. Reactivos y soluciones: 

KCl 0.154M



Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4



2,6 Diclorofenolindofenol 0,02%



Succinato 0,1 M



Malonato 0,1 M



Cianuro de sodio 0.1 M



Barbiturato de sodio 0.1 M



p-Fenilendiamina 1% en KCl 0.154M

2

MÉTODOS A. Sistema de incubación con el sustrato oxidable Succinato: COMPONENTES (mL)

TUBOS DE VIDRIO

Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4

1 1.5

2 1.2

3 1.0

4 0.5

5 0.5

6 0.5

2,6 Diclorofenolindofenol 0,02%

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Succinato 0,1 M

0.2

---

0.2

0.2

0.2

0.2

Malonato 0,1 M

---

---

---

0.5

---

---

Cianuro de sodio 0.1 M

---

---

---

---

0.5

---

Barbiturato de sodio 0.1 M

---

---

---

---

---

0.5

Homogenizado hepático

---

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente por espacio de 15 minutos. Observar, registrar los cambios de color del indicador e interpretar los resultados. B. Sistema de incubación con el indicador p-fenilendiamina COMPONENTES (mL)

TUBOS DE VIDRIO 1

2

3

4

5

Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4

2.0

1.5

1.0

1.0

1.0

Cianuro de sodio 0.1 M

---

---

0.5

---

---

Malonato 0,1 M

---

---

---

0.5

---

Barbiturato de sodio 0.1 M

---

---

---

---

0.5

p-Fenilendiamina

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Homogenizado hepático

---

0.5

0.5

0.5

0.5

3

Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente por espacio de 15 minutos. Observar, registrar los cambios de color del indicador e interpretar los resultados.

RESULTADOS: 1. Sistema de Succinato TUBO

1

2

3

4

5

6

COLOR

Azul

Azul verdoso

Azul verdoso

Marrón claro

OxidoReducció n

Quedó oxidado

Quedó oxidado

Marrón claro De oxidado a reducido

Quedó oxidado

De oxidado a reducido

Marrón claro De oxidado a reducido

2. Sistema de p-fenilendiamina TUBO

1

2

3

4

5

COLOR

Incoloro

OxidoReducció n

Quedó reducido

Marrón oscuro De reducido a oxidado

Marrón claro Quedó reducido

Marrón oscuro OxidoReducción

Marrón oscuro Quedó reducido

DISCUSIÓN Según Stryer (2001), los inhibidores si atacan a un complejo, este se verá impedido de pasar electrones al siguiente, por lo que no ocurrirán las reacciones de óxido – reducción. Sistema de Succinato (Aceptor de electrones el indicador)  El tubo ºN 1 contiene Buffer Fosfato, 2,6 diclorofenolindofenol (indicador), Succinato (sustrato) pero no tiene el homogenizado hepático (enzima), Por lo que no hay reacción entre E/S y no se liberan electrones para que pueda captarlos el indicador. Entonces este queda oxidado.

4

 El tubo ºN 2 contiene buffer, indicador, las enzimas, pero no el sustrato. Por ello no se liberan electrones para que pueda captarlos el indicador. Quedando nuevamente oxidado.  El tubo ºN 3 contiene buffer, indicador, sustrato, enzimas. Se puede decir que hay una reacción ideal E/S. Captando los electrones el indicador. Cambiando de oxidado a reducido.  El tubo ºN 4 contiene buffer, indicador, sustrato, las enzimas y Malonato (Ataca al complejo II). El inhibidor no permite que la enzima se una con su sustrato. Quedando el indicador oxidado.  El tubo ºN 5 contiene buffer, indicador, sustrato, las enzimas y el Cianuro (Ataca al complejo IV). Como el indicador solo capta los electrones procedentes del complejo II, y el inhibidor presente bloquea el complejo IV. Entonces cambia de oxidado a reducido.  Finalmente, en el tubo °N 6 contiene buffer, indicador, sustrato, las enzimas y el Barbiturato (Ataca al complejo I). Como el inhibidor bloquea al complejo I, y el indicador trabaja con el complejo II. Pasa de oxidado a reducido.

Sistema de p-Fenilendiamina (Aceptor de electrones el oxígeno)  El tubo ºN 1 contiene buffer y p-Fenilendiamina (sustrato-indicador), pero no tiene el hemogenizado hepático (enzimas). Es por ello que no ha cambiado de color. Indicando que ha quedado reducida.  En el tubo ºN 2 contiene buffer, el sustrato-indicador, y las enzimas. Por lo que la enzima actúa sobre su sustrato, liberando electrones. Y estos últimos son captados por el oxígeno. Cambiando de reducido a oxidado.  En el tubo ºN 3 contiene buffer, sustrato-indicador, las enzimas y el cianuro (ataca al complejo IV). Por lo que el oxígeno no capta los electrones. Quedando entonces reducido.  En el tubo ºN 4 el contiene buffer, el sustrato-indicador, las enzimas y el malonato (Ataca al complejo II). Aunque el complejo dos este bloqueado, queda el complejo I, que es el que manda los electrones al oxígeno. Cambiando de reducido a oxidado.  En el tubo ºN 5 contiene buffer, sustrato-indicador, las enzimas y el Barbiturato (Ataca al complejo I). Aun así el complejo II manda los electrones al oxígeno. Cambiando de reducido a oxidado. 5

Según Ramírez (2010) en condiciones normales, la citocromooxidasa tiene papel primordial en la utilización del oxígeno por la célula. Su inhibición conlleva interrupción de la respiración celular que deriva en hipoxia citotóxica y, precisamente, el cianuro es tóxico para el organismo debido a que se une al ión férrico de la citocromooxidasa en la mitocondria e interrumpe el uso del oxígeno por la célula, condicionando que la saturación de O 2 en la sangre venosa y arterial sea igual. Así, paradójicamente, el intoxicado muere por hipoxia, pero ahogado en un mar de oxígeno al que no puede utilizar; el color rojo brillante de la sangre venosa evidencia esa incapacidad. Además, el cianuro se liga al 2% de la metahemoglobina presente en el organismo CONCLUSIONES 

El Barbiturato de sodio impide la transferencia de electrones a nivel de complejo I.



El Malonato inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo II.



El cianuro de sodio inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo IV, siendo es el más letal de todos, ya que este interrumpe el uso del oxígeno por la célula. El intoxicado muere por hipoxia, pero ahogado en un mar de oxígeno al que no puede utilizar.

BIBLIOGRAFIA 

Blanco A. (2001). QUÍMICA BIOLOGICA, 8ta edición, Editorial El Ateneo.



Villalobos

C.

(2017).

enzimática.

Regulación

México.

Recuperado

de:

https://es.khanacademy.org/science/biology/energy-and-enzymes/enzymeregulation/a/enzyme-regulation 

Martínez

J.

Aguascalientes.

(2016).

Inhibidores

enzimáticos.

Aguascalientes,

México.

Universidad

Autónoma

Recuperado

de de:

http://libroelectronico.uaa.mx/index.html 

Stryer L. (2002), BIOQUÍMICA, 5ta edición, Editorial Reverte S.A.



Ramírez V. (2010). Toxicidad del cianuro: Investigación bibliográfica de sus efectos en animales y en el hombre. 71( 1 ): 54-61.

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ANEXOS

Fig. 01 Resultados del SISTEMA DE SUCCINATO.

Fig. 02 Resultados del SISTEMA DE PFENILENDIAMINA

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