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FOSFORILACIÓN OXIDATIVA Cada molécula de ATP se recicla aproximadamente unas 300 veces al día Estamos constantemente gastando y fabricando ATP La fosforilación oxidativa es el proceso por el cual se sintetiza ATP empleando la energía desprendida durante la transferencia de electrones en la cadena respiratoria mitocondrial. La enzima responsable de esta síntesis es la ATP sintasa La respiración celular o flujo de electrones desde el NADH (FADH2) al O2 es un proceso exergónico

LA TEORÍA QUIMIOSMÓTICA La Hipótesis Quimiosmótica de Mitchell (1961) explica la síntesis de ATP acoplada al gradiente protónico generado por el TEM. EVIDENCIAS Y OBSERVACIONES. 1) Fosforilación oxidativa requiere de una mmi intacta. 2) La mmi es impermeable a iones como H+, OH-, K+, Cl-. 3) El TEM promueve el transporte de H+ al espacio intermembrana o fuera de las mitocondrias intactas, creando un gradiente electrónico medible a través de la mmi. 4) Los compuestos que aumentan la permeabilidad de la mmi a los H+ disipan el gradiente electroquímico inhibiendo la síntesis de ATP: se desacopla el TEM de la fosforilación oxidativa. DEMOSTRACIÓN HIPÓTESIS QUIMIOSMÓTICA. La bacteriorodopsina es una bomba dependiente de la luz que se encuentra en las halobacterias. En un lado de esta vesícula pusieron una ATP sintasa mitocondrial purificada del hígado de buey. Cuando se iluminaba, la bacteriorodopsina bombeaba protones y pasado un tiempo sintetizaba ATP. Conclusión: en la fuerza protón-motriz está contenida la energía necesaria para fabricar ATP

FUERZA PROTÓN-MOTRIZ. El gradiente protónico genera la fuerza responsable de la síntesis de ATP. El movimiento de H+ genera un doble gradiente: de pH y de carga eléctrica.¿Cuál es la energía libre inherente al gradiente de pH (químico) y al de carga (eléctrico)? Fuerza protón-motriz (Δp) = gradiente químico (ΔpH) + gradiente eléctrico (ΔΨ)

TEMA 6 FOSFORILACIÓN OXIDATIVA 1

LA ATP SINTASA

Es la enzima que sintetiza ATP en las células a partir de ADP y de Pi

Esta enzima tiene dos subunidade: -

F1: es la parte catalítica, es la encargada de la síntesis de ATP. Presenta cinco cadenas polipeptídicas diferentes: o α: une NT o ß: une NT y sintetiza ATP o ɣ: parte del tallo central (rota) o ℇ: parte del tallo central (rota) o Ϭ: parte de la columna externa, impide que la cabeza rote

-

F0: canal protónico. Es el lugar por donde van a entrar y salir los protones. Se compone de: o Anillo c: conducto proteico que forma parte del rotor de la enzima junto con ɣ y ℇ. o Una subunidad α y dos subunidades ß que forman parte de la columna externa

MECANISMOS DE SÍNTESIS DE ATP POR LA ATP SINTASA Inicialmente se creyó que el gradiente de H+ sería necesario para la síntesis de ATP por la ATP sintasa pero el complejo enzima-ATP se forma sin necesidad de la fuerza protón-motriz, es decir, en la superficie de la enzima la reacción: TEMA 6 FOSFORILACIÓN OXIDATIVA 2

Enz-ATP  Enz (ADP + Pi)

La ΔGº es muy próxima a 0.

El gradiente de protones es necesario para que el ATP abandone el centro catalítico

MECANISMO CATALÍTICO DE LA F1 Experimentos isotópicos con agua con oxígeno 18; en unos minutos el Pi contienen todos los átomos de oxígeno marcados lo que indica que la hidrólisis y la síntesis de ATP ha tenido lugar varias veces: la subunidad F1 es capaz de sintetizar ATP en ausencia de gradiente protónico Entonces, ¿por qué se requiere el gradiente protónico? El gradiente protónico no es necesario para la síntesis de ATP sino para que el ATP abandone el centro catalítico de la ATP sintasa

CATÁLISIS ROTACIONAL La subunidad β puede unir ADP y Pi para formar y liberar ATP y en cada paso va variando su conformación. La subunidad β puede tener las siguientes conformaciones: -

L (loose): une ADP + Pi T (tight): une ADP + Pi y forma ATP (open): permite liberar al nucleótido

El cambio de una conformación a otra está mediado por la rotación de γ (L T  OL T…), es decir, la interconversión de las 3 formas se realiza gracias a la rotación de la subunidad γ que es asimétrica. Los cambios conformacionales están impulsados por el paso de protones a través de la F1. Las alteraciones progresivas de las formas de los centros activos (subunidades β) están promovidas por el movimiento de la subunidad γ impulsado por el flujo protónico. La ATP sintasa es el motor molecular más pequeño del mundo. La demostración de la rotación se llevó a cabo mediante la adición y posterior hidrólisis del ATP que promueve la rotación unidireccional del filamento de actina en sentido contrario a las agujas del reloj (saltos de 120º). Los transportadores mitocondriales son necesarios para meter ADP+Pi en la mitocondria porque no está permitido el paso libre a través de la membrana, en este caso se llama translocasa. Cuando está abierto al citoplasma coge ADP se da la vuelta y lo suelta, al quedar libre el lugar de unión, coge ATP se da la vuelta y lo suelta en el citosol. Hay dos sistemas de transporte del Pi: -

Simporte ligado a H+ Antiporte ligado a OHTEMA 6 FOSFORILACIÓN OXIDATIVA 3

REVERSIBILIDAD DE LA ATP SINTASA En condiciones de hipoxia, la cadena de transporte de electrones funciona muy poco, pero se sigue necesitando el gradiente protónico. Entonces es la ATP sintasa la encargada de bombear los protones

REGULACIÓN DE LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA La fosforilación oxidativa se regula en base a las necesidades energéticas celulares, es decir, por los niveles de [ATP] / [ADP] [P]. Un aumento de ADP estimula la formación de ATP, además si la célula no precisa ATP se ralentizan los procesos metabólicos. El gradiente protónico se utiliza también en la síntesis de NADPH de la fotosíntesis, en la producción de calor, en el potencial eléctrico que controla muchos procesos celulares, en el transporte activo y en la rotación flagelar.

ESTEQUIOMETRÍA DE LA SÍNTESIS DE ATP Cálculos antiguos: por cada NADH se forman 3 ATP y por cada FADH2 se forman 2 ATP Cálculos actuales: por cada NADH se forman 2.5 ATP y por cada FADH2 se forman 1.5 ATP

BALANCE DE LA OXIDACIÓN COMPLETA DE LA GLUCOSA A CO2 Y H2O C6H12O6 + 6O2  6CO2 + 6H2O ¿Cuántos ATP se forman en la oxidación completa de la glucosa? Para calcularlo debemos tener en cuenta: 1. Los ATP que se forman en la glucólisis por fosforilación a nivel de sustrato 2. La cantidad de CoE reducido (NADH/FADH2) que se genera en la glucólisis, la reacción del complejo de la PDH y el ciclo de Krebs 3. La lanzadera empleada para reoxidar el NADH citosólico Balances tradicionales: 1NADH = 3ATP; 1FADH2 = 2ATP -

Lanzadera malato-aspartato: 38ATP Lanzadera glicerol3P: 36ATP

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DESACOPLANTES DEL TRANSPORTE ELECTRÓNICO Y LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA Los inhibidores bloquean el transporte a diferentes niveles o complejos de la cadena de TEM. De la misma manera también existen inhibidores de la ATP sintasa, como el DCCD oligomicina. Muchos de ellos están presentes en hongos y otros microorganismos. Los desacoplantes son agentes que evitan que el flujo de electrones genere un gradiente protónico y ello produce los siguientes efectos: -

No hay síntesis de ATP. La energía se disipa como calor. Incremento del consumo de O2. Incremento de la oxidación de NADH.

Hay dos tipos: 1. Desacoplantes ionóforos, como el 2,4-DNP (dinitrofenol), son moléculas transportadoras de protones situadas en el lado de la matriz y que cogen los protones difundiéndolos hacia el otro lado de la membrana, evitando así el que se forme el gradiente. 2. Proteínas que forman parte de la mmi. Son canales a través de los cuales se cuelan los protones, como no pueden volver a través del mismo canal se forma un gradiente. Estas proteínas son las UCP (uncoupling protein) y en concreto la UCP-1 o termogenina. Algunos doctores recetaron desacoplantes como adelgazantes pero, pese a tener buenos resultados, su consumo conducía a la muerte. Esto es debido a que el organismo si no tiene ATP moviliza las reservas energéticas contenidas en las grasas. Con esto no se forma ATP y muchos procesos imprescindibles para la vida no tienen lugar.

LA TERMOGÉNESIS Desacoplar el TEM produce calor: si la energía no se emplea para fabricar ATP, se transforma en calor y esta transformación tiene lugar en el tejido adiposo pardo o BAT; es el proceso de la termogénesis. Los bebés acabados de nacer presentan BAT en la espalda y pecho para producir calor y poder sobrevivir. El BAT es un tejido muy rico en mitocondrias cuyos citocromos le dan color pardo. Lo que desencadena este proceso es una respuesta hormonal a través de la noradrenalina la cual interactúa con su receptor. Esto activa la adenilatociclasa que provoca la fabricación de AMPc que activa la PKA que fosforila la triacilgliceroldolipasa que moviliza las reservas de grasa. Forma ácidos grasos que son sustrato de la cadena respiratoria transformándose en acetil-CoA. Además abren un canal, la termogenina, por el que los protones se cuelan a la matriz mitocontrial disipándose el gradiente y parando la síntesis de ATP.

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La termogénesis está muy relacionada con la hibernación. En los 7 meses que hiberna un oso pardo, este conserva su temperatura corporal entre los 32-35ºC. Esto lo consigue mediante la oxidación de la grasa parda y obtiene energía para otras reacciones. La oxidación de las grasas también repone el agua perdida en la respiración. El glicerol que proviene de la degradación de las grasas es un precursor gluconeogénico por el que se forma glucosa para abastecer al cerebro. La urea es reciclada para formar aminoácidos y proteínas.

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