T4. GLUCÓLISIS Y DESCARBOXILACIÓN OXIDATIVA DEL PIRUVATO PDF

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TEMA 4. GLUCÓLISIS Y DESCARBOXILACIÓN OXIDATIVA DEL PIRUVATO La glucosa, en su proceso de degradación en el interior del organismo, puede seguir varios caminos: -

Almacenamiento en forma de glucógeno (hígado y músculo esquelético estriado) Oxidación. La glucosa se puede degradar por dos vías metabólicas diferentes: ✓ Glucólisis; se hidroliza la glucosa en dos moléculas de piruvato ✓

Vía de las pentosas fosfato; se genera un intermediario metabólico, la ribosa-5-fosfato

En este tema nos centraremos en una de los dos tipos de oxidación que sufre la glucosa: la glucólisis . La glucólisis transcurre únicamente en el citoplasma celular, y constituye la ruta central del metabolismo de la glucosa. Está formada por un conjunto de 10 reacciones cuyo producto final son 2 moléculas de piruvato o ácido pirúvico. Se pueden distinguir dos fases , en relación al gasto energético que se produce: - Fase I o de inversión energética, que implica un gasto de ATP - Fase II o de obtención energética, en la que se obtiene energía en forma de ATP  A pesar de que en la primera fase se consume una cierta cantidad de energía, el balance neto es positivo, es decir, que en la segunda fase se produce más ATP del que se produce en la primera. La ruta más importante de la oxidación de la glucosa es la glucólisis. Distinguimos entre dos mecanismos diferentes dependiendo de la disponibilidad de oxígeno: -

Aerobio. Ocurre en presencia de oxígeno; permite la degradación completa de la glucosa (degradación oxidativa). Se producen 38 ATP/mol de glucosa. Anaerobio. Ocurre en ausencia de oxígeno; sin cambio neto del estado de oxidación. Se producen 2 ATP/mol glucosa.

La glucólisis está sometida a diferentes tipos de regulación: -

Regulación alostérica Regulación a nivel de sustrato Regulación por modificación covalente Regulación expresión y distribución celular Regulación hormonal (insulina, glucagón…)

También participan en la regulación diferentes enzimas , entre las que destacan: -

Hexoquinasa

-

Fosfofructoquinasa Piruvatoquinasa CAPTACIÓN CELULAR DE LA GLUCOSA

La glucosa por su polaridad, no puede atravesar libremente la membrana, sino que se requieren transportadores, que en general se denominan ‘GLUT’. Antes de comenzar la glucólisis propiamente dicha, la glucosa debe pasar al interior celular (citoplasma); este proceso se encuentra regulado. Los principales transportadores celulares de glucosa que encontramos son: -

-

GLUT 1. Es un transportador ubicuo (se encuentra en todos los tejidos), en particular se encuentra en los eritrocitos (células desprovistas de orgánulos). Este transportador posee afinidad media y no es sensible a la insulina (no depende de esta para que se produzca el transporte al interior de la membrana). GLUT 2. Se localiza principalmente en el hígado, páncreas (células β pancreáticas) y riñón. Posee baja afinidad y no es sensible la insulina.

-

-

GLUT 3. Se localiza mayoritariamente en el cerebro. Posee alta afinidad y no es sensible a la insulina. El hecho de que posea alta afinidad es muy importante ya que debe mantener al cerebro siempre nutrido. GLUT 4. Se localiza principalmente en el músculo y en el tejido adiposo. Posee afinidad media y es sensible a la insulina (depende de ella para que se produzca el transporte; necesita ser regulado. Evita que en ayunos prolongados no se quite la glucosa destinada al cerebro).

GLUT 4 se encuentra dentro de la célula en vesículas. Cuando la concentración de insulina es elevada, se produce una señal que hace que GLUT 4 se transloque a la membrana para captar glucosa (cuando la concentración de insulina es baja, la glucosa no se transporta). Por lo tanto, posee una regulación por el nivel de sustrato. -

GLUT 5. Se localiza principalmente en el intestino o en los músculos . Posee afinidad media-baja y no es sensible a la insulina. Es poco específico, debido a que también transporta fructosa. GLUT 7. Presenta alta afinidad por la glucosa y por la fructosa SGTL 1. Realiza la captación de glucosa en contra de gradiente. Presenta afinidad por la glucosa y la galactosa. Se encuentra acoplado a la captación del ión Na+

La presencia o no de transportadores supone un tipo de regulación “regulación por sustrato”. Aunque las enzimas de la glucólisis estén activadas, si no hay transportadores o están defectuosos, la glucólisis no se produce. GLUCÓLISIS Una vez la glucosa ya está en el interior celular, se lleva a cabo el proceso de glucólisis. Vamos a dividir el proceso de la glucólisis en 2 fases: Fase I: 1. Fosforilación a nivel de sustrato catalizado por la enzima hexoquinasa (irreversible). Supone la pérdida de 1 ATP. 2. Isomerización de la glucosa-6-fosfato a fructosa-6-fosfato mediante la enzima fosfoglucoisomerasa. 3. Fosforilación-sustrato de fructosa-6-fosfato a fructosa-1,6-bisfosfato mediante la enzima fosfofructoquinasa (irreversible). Supone la pérdida de 1 ATP. 4. Ruptura de fructosa-1,6-bisfosfato (compuesto rico en energía) por acción de una aldolasa en: - Dihidroxiacetona-fosfato - Gliceraldehído-3-fosfato (G3P) 5. Isomerización de la dihidroxiacetona-fosfato en gliceraldehído-3-fosfato, a través de la enzima triosa-fosfato isomerasa. Balance energético (Fase I): 1 Glucosa + 2ATP

2 G3P + 2ADP

Fase II. Todos los procesos hay que contarlos por dos: 1. Oxidación y fosforilación del gliceraldehído-3-fosfato a 1,3-Bisfosfoglicerato. Se produce la reducción del

2.

3. 4. 5.

NAD a NADH + H+. No requiere ATP pero sí fósforo inorgánico. La enzima que cataliza esta reacción es la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Fosforilación-sustrato. Paso de 1,3-Bisfosfoglicerato a 3-fosfoglicerato catalizado por la enzima fosfoglicerato quinasa. Se sintetiza una molécula de ATP gracias a la fosforilación de un ADP con un fósforo del 1,3-bisfosfoglicerato, que se defosforila. Isomerización. Se pasa de 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato, gracias a la ayuda de la enzima, la fosfoglicerato mutasa. Deshidratación. Paso de 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato (rico energéticamente). Se produce la pérdida de una molécula de agua. La reacción es catalizada por la enzima enolasa. Fosforilación-sustrato. Se pasa de fosfoenolpiruvato a piruvato. Ganancia de una molécula de ATP a partir de ADP y fósforo del fosfoenolpiruvato. La reacción es catalizada por la enzima piruvato quinasa.

Balance energético (Fase II): 1 G3P + 1 NAD+ + 2 ADP

1 Piruvato + 1 NADH + H+ + 2 ATP + 1 H2O (x2)

 2 G3P + 2 NAD+ + 4 ADP

2 Piruvato + 2 NADH + 2 H+ + 4 ATP + 2 H2O

BALANCE NETO DE LA GLUCÓLISIS: 1 GLUCOSA + 2 Pi + 2 ADP + 2 NAD+

2 PIRUVATO + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O

Los 2 NADH + H + deben reoxidarse para obtener cierta energía de ellos. El NADH + H + no puede simplemente introducirse en las mitocondrias para oxidarse mediante la cadena transportadora de electrones porque la membrana mitocondrial interna es impermeable a NADH y NAD+. La solución consiste en que sean los electrones del NADH, y no el propio NADH, quienes atraviesen la membrana mitocondrial. Para conducir estos electrones hacia la cadena transportadora de electrones se requiere una lanzadera, la lanzadera del glicerol-3-fosfato. La primera etapa de la lanzadera consiste en la transferencia de un par de electrones desde el NADH a la dihidroxiacetona fosfato, un intermediario de la glucólisis, para formar glicerol-3-fosfato, reacción catalizada por la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa del citosol. El glicerol-3-fosfato se reoxida a dihidroxiacetona fosfato en la cara externa de la membrana mitocondrial interna mediante una isoenzima de la glicerol -3-fosfato deshidrogenasa unido a la membrana. Un par de electrones del glicerol-3-fosfato se transfieren al FAD para formar FADH 2. Esta reacción regenera la dihidroxiacetona fosfato. Por lo tanto, cuando la cadena respiratoria oxida el NADH citosólico que transporta la lanzadera del glicerol-3-fosfato se forman 2 ATP, en vez de 3, siendo el rendimiento menor porque en la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa mitocondrial el aceptor de electrones es FAD en lugar de NAD+. (BIOQUÍMICA. Stryer, 5º edición )

 6 ATP/mol de glucosa REGULACIÓN DE LA GLUCOLISIS • Hexoquinasa Isoformas Distribución tisular Afinidad Control a corto plazo Control a largo plazo Redistribución subcelular

Hexoquinasas I,II,III Ubicua - Alta - Baja Km (0,1 mM) Retroinhibición por G6P (inhibición por producto) Constitutivas (siempre presente) No hay: siempre en el citoplasma

Hexoquinasa IV (Glucoquinasa) Hígado y células beta pancráticas - Baja - Alta Km (10 mM) No retroinhibición por G6P Inducible por insulina Sí (está en el núcleo unida a una proteína reguladora, inactiva; por acción de la insulina se transloca al citoplasma, se libera de su regulador y se activa).

Cuando existe un exceso de glucosa, la glucosa-6-fosfato inhibe la hexoquinasa y deja de fosforilar la glucosa, por lo que llegarían los excesos al hígado y se almacenaría en forma de glucógeno y de ácidos grasos. En situaciones de ayuno disminuye la captación de glucosa por parte del hígado, y se produce poca fosforilación de la hexoquinasa I, II y III, de forma que solo se produce el ATP necesario. La hexoquinasa IV no actúa en este caso. • Fosfofructoquinasa Esta enzima tiene una estructura de tetrámero. Tiene varios tipos de inhibición: -

-

-

Inhibición alostérica por ATP y activación por ADP y AMP (bajas concentraciones de ATP). El AMP también se conoce como sensor de la carga energética celular Citrato. Inhibe la fosfofructoquinasa cuando está en concentraciones elevadas; el citrato se obtiene en el ciclo del ácido cítrico, e indica que hay ATP suficiente en la célula. Fructosa-2,6-bisfosfato. Esta molécula activa la glucólisis; sus concentraciones celulares están muy relacionados con la gluconeogénesis (si la gluconeogénesis está activada, la glucólisis está inhibida, y viceversa; el significado biológico reside en que si ambas rutas estuviesen activadas, esto supondría un gasto inútil de energía). Presenta regulación hormonal, por acción de insulina o glucagón (según el estado fisiológico en que se encuentre la célula).

• Piruvato quinasa Existe una isoforma “M”, distribuida en todos los tejidos (más en el músculo) , y otra “L”, exclusiva del hígado. -

Isoforma “M”. Posee mayoritariamente regulación alostérica ✓ Activación. Fructosa-1,6-bisfosfato ✓ Inhibición. » ATP » Acetil-CoA (actúa de manera similar al citrato) Ácidos grasos Alanina (Ala). Este aminoácido se puede obtener a partir del piruvato, por lo que si existen concentraciones elevadas de alanina, significa que hay mucho piruvato. Isoforma “L”. Presenta los siguientes tipos de regulación: ✓ Regulación alostérica. Es igual que en la isoforma “M”. ✓ Regulación covalente. » Activación: defosforilación. La defosforilación la lleva a cabo la enzima fosfoproteína fosfatasa (PP1). » Inhibición: fosforilación. La fosforilación de la piruvato quinasa se lleva a cabo por la proteína quinasa A (PKA), y es una reacción reversible. La PKA se activa cuando las » »

-

✓

concentraciones de AMPc son altas (si las concentraciones de AMPc disminuyen, la PKA se inactiva). Regulación hormonal. » Glucagón. Activa la producción de AMPc intracelular, con lo que indirectamente fosforila la piruvato quinasa, parando la glucólisis. » Insulina. Tiene acción contraria al glucagón. Activa la PP1 indirectamente.

EL DESTINO DEL PIRUVATO El destino del piruvato depende de la existencia o no de oxígeno molecular: -

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Cuando hay oxígeno en el ambiente, el piruvato se transforma en Acetil-CoA a través de la descarboxilación oxidativa. En esta ruta se obtiene gran cantidad de energía, en forma de ATP, y poder reductor, como NADH + H+. Por el contrario, cuando no hay presencia de oxígeno, se produce la fermentación del piruvato. Esta fermentación puede ser de dos tipos, alcohólica y láctica, y se diferencian únicamente en el producto final de estas reacciones: si el piruvato se transforma en etanol , hablamos de una fermentación alcohólica, pero si se transforma en ácido láctico, la fermentación es láctica. FERMENTACIÓN

La fermentación se produce en condiciones anaerobias , y su objetivo es la regeneración del NAD+. Este NAD+ puede incorporarse de nuevo en el inicio de la glucólisis, para poder seguir obteniendo una cierta cantidad de energía. En mamíferos solo se produce la fermentación láctica, con lo que nos centraremos solo en el estudio de la misma. Las bacterias de la flora intestinal también realizan la fermentación láctica, que crea un descenso en el pH del intestino debido a la producción de ácido láctico; esta bajada del pH se produce dentro de un rango fisiológico, pero es suficiente para evitar el crecimiento de bacterias ajenas y patógenas. FERMENTACIÓN LÁCTICA: En la fermentación láctica, el piruvato se transforma en ácido láctico en una reacción catalizada por la enzima lactato deshidrogenasa, y a la cual se acopla la oxidación de NADH + H+ a NAD+ (es este NAD+ el que ya se ha comentado que vuelve al inicio de la glucólisis para obtener cierta cantidad más de energía). Esta reacción puede ser reversible. LDH

Pyr

NADH+H+

Ácido láctico NAD+

La fermentación láctica se produce, con mucha frecuencia, cuando realizamos ejercicio en “malas condiciones”, es decir, cuando el aporte de oxígeno al músculo es deficiente. Así, al producirse el ácido láctico, este se acumula en forma de cristales, que provocan las conocidas “agujetas” La enzima lactato deshidrogenasa (LDH), se encuentra presente en el citoplasma de todas las células del organismo, ya que si se produjese una disminución de la presión parcial de oxígeno, se llevaría a cabo la reacción de fermentación hasta que las condiciones se restableciesen. Además, la LDH se usa como marcador de daño celular, ya que su salida de la célula al exterior viene dada por la rotura de la membrana plasmática celular (muerte celular). El balance final de la fermentación es la producción de 2 ATP / mol de glucosa. Esto es así debido a que, al no haber O2, la cadena de transporte electrónico no puede activarse, puesto que falta su último aceptor de electrones. DESCARBOXILACIÓN OXIDATIVA Se produce en condiciones aerobias . El piruvato es una molécula polar, con lo que no puede atravesar la membrana mitocondrial; por tanto, es necesaria la existencia de transportadores, que son dependientes de un cotransporte de protones. Estos protones serán, en parte, responsables de la generación del gradiente electroquímico mitocondrial. El piruvato pasa a la matriz mitocondrial y es allí donde se produce su oxidación. La descarboxilación oxidativa es una reacción irreversible, ocurre en la matriz mitocondrial, y se puede representar mediante este esquema: CO2

Pyr

Acetil-CoA NAD+

NADH+H+

La descarboxilación oxidativa no forma parte de la glucólisis, sino que supone un nexo de unión entre esta y el ciclo del ácido cítrico. Esta reacción está catalizada por un complejo multienzimático denominado complejo piruvato deshidrogenasa (PDH). Está formado por tres enzimas unidas , pero cuyas actividades son diferentes. Cada una de estas enzimas requiere de un cofactor, que es en realidad una coenzima. Enzima Piruvato descarboxilasa (E1) Dihidrolipoilo transacetilasa (E2)

Cofactor (coenzima) Pirofosfato de tiamina (TPP) – Vitamina B 1 Ácido lipoico o lipoamida – No vitamínica

Dihidrolipoilo deshidrogenasa (E3)

FAD – Vitamina B2

Reacción catalizada Descarboxilación oxidativa del piruvato Transferencia del grupo acetilo al CoA Regeneración de la forma oxidada del ácido lipoico

El complejo multiemzimático PDH ofrece una eficiencia catalítica, que no existiría si estuviesen las tres enzimas aisladas; así, se produce una catálisis coordinada, un aumento de la velocidad de reacción y se minimiza la posibilidad de reacciones laterales. Un déficit en el complejo PDH puede suponer: -

Acumulación del ácido láctico Elevación de los niveles de glucosa, ya que no se metaboliza correctamente. Esto provoca una acidosis láctica, pudiendo llegar a producir problemas neurológicos graves en casos extremos. Intolerancia a la glucosa Diabetes

El mecanismo de la PDH es muy complejo. La conversión de piruvato en acetil-CoA tiene lugar en tres etapas acopladas para poder conservar la energía libre derivada de la descarboxilación y permitir la formación de NADH y acetil-CoA. Posteriormente a estas tres etapas, se produce una cuarta reacción. I.

Descarboxilación. El piruvato se combina con el TPP y se descarboxila, expulsando una molécula de CO2. Esta reacción está catalizada por el componente E1 de la PDH (piruvato descarboxilasa). Pyr + TPP

Acetil-TPP + CO2

II. Oxidación. El TPP unido al grupo acilo se oxida para formar un grupo acetilo libre y se transfiere a la lipoamida, a la cual se une mediante un enlace amida a la cadena lateral de lisina. En esta reacción, el oxidante es el grupo disulfuro de la lipoamida, el cual se reduce a sulfhidrilo, y el producto que se obtiene es acetil-lipoamida. Esta reacción también la cataliza la E1 de la PDH. Acetil-TPP + Lipoamida

Acetil-Lipoamida + TPP

III. Transferencia del grupo acetilo. Esta transferencia se produce desde la acetil-lipoamida al CoA para formar acetil-CoA y está catalizada por la E2 de la PDH (dihidrolipoilo transacetilasa). El enlace tioéster rico en energía se mantiene hasta la transferencia del grupo acetilo al CoA. En este momento ya se ha obtenido a partir del piruvato el acetil-CoA, el combustible del ácido cítrico, y otro compuesto reducido, la dihidrolipoamida. Acetil-Lipoamida + CoA

Acetil-CoA + Dihidrolipoamida

 El complejo PDH no puede realizar otro ciclo catalítico hasta que la dihidrolipoamida sea oxidada a lipoamida. IV. Regeneración de la lipoamida. Esta reacción la lleva a cabo la E3 de la PDH (dihidrolipoilo deshidrogenasa). La regeneración de la lipoamida es una reacción de oxidación, y por ello se produce una transferencia de electrones a un grupo FAD de la enzima, y posteriormente al NAD +.  Ahora ya sí que se puede iniciar otro ciclo de reacción.

Podría expresarse el balance final de la descarboxilación oxidativa mediante el siguiente esquema: Pyr + CoA + NAD+

CO2 + Acetil-CoA + NADH+H+

La piruvato deshidrogenasa, tiene varios mecanismos de regulación: -

Regulación alostérica. En esta se produce inhibición por producto. Cuando las concentraciones tanto de ATP como de Acetil-CoA son altas, la enzima se inhibe; es decir, cuando la carga energética celular es elevada. Regulación covalente. Se produce una fosforilación/desfosforilación (mecanismo reversible) ✓ Activación: defosforilación. Es llevada a cabo por la fosfoproteína fosfatasa*, liberando un fósforo inorgánico. ✓ Inhibición: fosforilación. Se lleva a cabo mediante una quinasa**, catalizando la hidrólisis de una molécula de ATP a ADP.

-

*Regulación de la fosfoproteína fosfatasa -

Activación: Mg2+ y Ca2+ (muy importante esta activación en el músculo).

**Regulación de la quinasa -

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Activación: ✓ Acetil-CoA ✓ NADH+H+ Inhibición: ✓ ADP (baja carga energética celular) ✓ Pyr ✓ NAD+ ✓ CoA

A continuación, el Acetil-CoA se va a incorporar en la fase III del metabolismo oxidativo, ciclo del ácido cítrico principalmente. El NADH+H+ procedente de la descarboxilación del piruvato debe pasar del citosol a la matriz mitocondrial para poder incorporarse en la cadena respiratoria y producir energía útil (ATP). Como no puede pasar directamente, debido a la impermeabilidad de la membrana mitocondrial interna, se utilizan las denominadas lanzaderas. Las lanzaderas más importantes son: -