8 Principali Saggi Immunologici PDF

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PRINCIPALI SAGGI IMMUNOLOGICI Se si mettono a contatto in vitro il siero di un animale immune verso uno specifico antigene con l’antigene corrispondente, si forma un immunocomplesso poiché gli anticorpi presenti nel siero reagiscono con l’antigene. Le tecniche immunologiche principali possono essere suddivise in cinque categorie: -

Reazioni di precipitazione: immunoprecipitazione; Reazioni di agglutinazione; Reazioni che utilizzano il complemento; Reazioni di neutralizzazione; Metodi immunologici in fase solida.

REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE L’immunoprecitazione è quel fenomeno ch si verifica in una soluzione in cui si ha la concomitante presenza di un antigene macromolecolare solubile e di un anticorpo diretto contro di esso, se le concentrazioni relative dei due reagenti sono sufficientemente elevate e pressoché equivalenti. In questo caso si vengono a formare immunocomplessi insolubili (reticoli tridimensionali) di dimensioni tali da precipitare non si ottiene quando nella soluzione si ha un eccesso di antigene o di anticorpo. In queste condizioni gli immunocomplesso rimangono in soluzione nel mezzo acquoso in quanto le dimensioni dei complessi antigene-anticorpo che si formano non sono tali da consentire la precipitazione. La reazione di precipitazione trova impiego nel dosaggio di tossine e anatossine. Quando l’immunoprecipitazione avviene all’interno di un gel si parla di immunodiffusione, essa comprende vari saggi che si basano sulla diffusione di (immunodiffusione radiale o singala) o entrambi i reagenti (immunodiffusione doppia), sulla separazione elettroforetica dell’antigene seguita dalla diffusione dell’anticorpo (immunoelettroforesi) o sulla separazione elettroforetica contemporanea di antigene e anticorpo (elettrosineresi).

REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE L’agglutinazione è quel fenomeno che si verifica se si mescola un siero immune specifico con una sospensione di agenti corpuscolati, che riunendosi in grandi agglomerati sedimentano sul fondo della provetta lasciando il sovrastante limpido. Agitando la provetta questi agglomerati tornando in sospensione, a differenza del caso della precipitazione, quindi sono sufficienti anche basse concentrazioni di anticorpo. Questo tipo di agglutinazione è detta diretta e ha un utilizzo clinicodiagnostico. L’agglutinazione indiretta prevede che le particelle di materiale inerte ricoperti da antigeni purificati vengano agglutinati dagli anticorpi specifici per tali antigeni. Questo tipo di agglutinazione è usata per la determinazione di anticorpi specifici. Abbiamo anche l’agglutinazione passiva e in lattice.

REAZIONI CHE UTILIZZANO IL COMPLEMENTO In presenza del complemento antigeni di superficie cellulare e anticorpi specifici danno luogo ad un processo di lisi, che non si verifica se il complemento è stato sottratto da una reazione antigeneanticorpo avvenuta in precedenza. Questo principio è alla base della reazione di fissazione o deviazione del complemento, che permette di evidenziare la formazione di un immunocomplesso in modo diretto, usando come indicatore l’emolisi.

REAZIONI DI NEUTRALIZZAZIONE Le reazioni di neutralizzazione consistono nel blocco dell’attività biologica di un antigene da parte del rispettivo anticorpo. Questa reazione può essere dimostrata inoculando il preparato, ottenuto mescolando l’antigene con il siero in esame, e osservando la comparsa o meno della malattia. Se compare la reazione è negativa altrimenti è positiva. Ci sono diversi tipi di reazioni di neutralizzazione: -

Delle esotossine: per valutarne la tossicità; Dell’infettività virale: per osservare la perdita della capacità infettiva virale; Emoagglutinazione virale: l’agglutinazione degli eritrociti è provocata dai virus.

METODI IMMUNOLOGICI IN FASE SOLIA I metodi si classificano in: -

Immunofluorescenza: è la prima tecnica a impiegare anticorpi marcati, esiste una tecnica diretta che consiste nel lasciare a contatto per un certo tempo un preparato microscopico del campione con l’antigene fissato su un vetrino, e anticorpi marcati con un fluorocromo; e una tecnica indiretta più versatile perché permette di ricercare la presenza di anticorpi specifici, in questo caso, ad un preparato microscopico contenente l’antigene noto fissato su un vetrino viene aggiunto prima un siero contenente l’anticorpo oggetto della ricerca, e in seguito un siero contenente anticorpi anti-immunoglobuline marcati con un fluorocromo.

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Metodi radioimmunologici: sono basati sulla competizione per il legame con un numero costante di siti anticorpali, tra una quantità fissa di antigene marcato con un isotopo radioattivo, e lo stesso antigene non marcato.

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Metodi immunoenzimatici: utilizzano anticorpi o antigeni specifici legati a enzimi marcatori, sono basati su una reazione immunologica che ne assicura la specificità, e su una enzimatica che garantisce la sensibilità analitica, i metodi più diffusi sono ELISA diretto e indiretto. Il metodo diretto prevede che all’antigene adeso alla base solida vada aggiunto un anticorpo direttamente marcato con un enzia. Nell’indiretto l’antigene viene adeso direttamente alla base solida, ma in questo caso l’anticorpo primario non viene direttamente marcato, ma verrà aggiunto un anticorpo secondario marcato, specifico contro quello primario. C ‘è anche un metodo competitivo che consiste nel far reagire una quantità nota di antigene marcato con un enzima e una quantità ignota dello stesso antigene libero con uno specifico anticorpo legato ad una fase solida. Sul sito di legame dell’anticorpo si crea una competizione tra l’agente marcato e non marcato.

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Immunoblot: permette di evidenziare anticorpi specifici verso polipeptidi antigenici di un microrganismo, solitamente un virus. Prima di usare questa tecnica va fatta un’eolettroforesi denaturante in gel per separare le varie proteine in funzione della massa e non della carica. Poi bisogna trasferire le proteine dal gel alla membrana di nitrocellulosa che viene incubata con il siero che contiene l’anticorpo specifico e successivamente con una soluzione contenente anticorpi anti-immunoglobuline marcati con un enzima. Infine l’aggiunta di un substrato cromogeno specifico per l’enzima fa si che sulla nitrocellulosa in corrispondenza delle frazioni antigeniche specifiche per gli anticorpi sia formino delle bande colorate. Viene utilizzato per confermare la positività a un test ELISA in particolare nel caso del virus dell’AIDS....