Ácidos Nucleicos PDF

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clases de Ácidos nucleicos...

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Ácidos Nucleicos Están dentro de las cuatro macromoléculas biológicas , proteínas, carbohidratos , lípidos y Ácidos nucleícos. Están formados por los nucleótidos , que tienen 3 estructuras el grupo fosfato , la pentosa y las bases nitrogenadas ( adenina , timina , citosina y guanina) Dependiendo de cómo se va conformando esta estructura de nucleótidos podemos tener un nucleótido monofosfato, difosfato o trifosfato (que es el nucleótido propiamente tal que conforma el ADN) tiene carga negativa y en la cadena de doble hélice están desplazados los grupos fosfatos hacia el exterior por lo tanto el DNA es negativo. El nucleótido tiene un nucleosido que es la conformación de la pentosa mas la base sin el grupo fosfato. El nucleótido tiene que formar enlaces y los dos principales se unen en el carbono 5 y en el carbono 1, el 5 es fosfodiéster y el 1 es N-glicosídico

Quinasas : son las que traspasan grupos fosfatos a otras moléculas Epigenetica : estudio de cómo los fenómenos ambientales pueden modificar nuestra expresión génica . aquí las modificaciones no son sobre la secuencia de ac nucleicos sino que sobre proteínas asociadas al ac nucleico.

AMP que es una molécula sintetizada en un genoma nuclear va a ir a formar enzimas que participan en las mitocondrias . El genoma nuclear es mas autónomo que el mitocondrial ya que este sintetiza todas proteínas, pero el mitocondrial sigue siendo importante de reconocer ya que hay enfermedades asociadas solo a el .

Las bases nitrogenadas son 5 , 4 contenidas en el ADN y el uracilo que cambia en el ARN . a su ves se subdividen en dos grupos , las puricas ( adenina Guanina) y las pirimidinicas ( citosina uracilo y timina) las puricas reciben otro nombre por su estructura molecular , y las pirimidinicas también. Si se degrada una purina en un primate el resultado seria acido úrico. Esto es importante , ya que si se esta haciendo un ensayo en un tubo y se quiere evaluar por ejemplo la degradación de bases puricas en un proyecto de investigación, lo que tengo que medir en este caso es el acido úrico o en la pirimidinicas agua, anhídrido carbónico y urea.

Además de las purinas y pirimidinas de las que hemos hablado anteriormente, es frecuente encontrar Bases Modificadas. Entre las mas abundantes encontramos: - la 5-metilcitocina, la 5-hidroximetilcitocina y la 6 metiladenina que se han relacionado con la regulación de la expresión del DNA . La 7-metilguanina y el dihidrouracilo que forman parte de la estructura de los RNA - Hipoxantina y Xantina como intermediarios metabólicos y productos de reacción del DNA con sustancias mutagenicas. Todas estas metilaciones son producidas por DNMT ( dimetiltransferasas) que transfieren o dos grupos metilos o uno y la características que tienen es que son mantenidas en el tiempo , entonces por ejemplo una afección que se le produjo a un bebe de estrés o un maltrato cambia toda la plasticidad neuronal y todas las expresión de los genes que están en la neurona y ese niño tendrá estos traumas a largo plazo a base de que cambio la expresión génica , pero no en la secuencia , sino en las metilaciones . El otro grupo de modificaciones asociadas a epigenetica son las histonas y estas no son tan mantenidas , son procesos de ensamblaje y desensanblaje esto provoca expresión y represión . Existen técnicas moleculares para identificar metilación en el ADN, en genes puntuales o se puede hacer una secuenciación completa para establecer cuantas metilaciones, por ejemplo si se ven genes relacionados al estrés , que cambia un monton de metilaciones uno puede aplicar estrés a un modelo y evaluar como cambia las metilaciones el control vs el estresado. Se puede hacer una secuenciación con bisulfito por ejemplo o una amplificación génica pre tratamiento con bisulfito.

Generalmente las metilaciones son en citosinas , si hay una secuencia que tiene citosinas metiladas se hace un tratamiento con bisulfito que lo hará es una conversión de las citosinas que no están metiladas a Uracilos , pero las que si lo están quedaran igual. Una vez realizada la amplificación en los uracilos se agrega dinucleótidos de timinas y todos los uracilos se cambian por timina , entonces cuando uno analiza esta secuencia todas las citosinas eran las que estaban metiladas . -La pentosa es el azúcar de los ácidos nucleicos, esta formada por 5 carbonos que puede ser ribosa ( ARN ) o desoxirribosa ( ADN) -Grupo fosfato: se alternan con la pentosa para formar la estructura del ADN , todas las moléculas que tienen grupos oxígeno va a depender del Ph al cual se encuentre para estar o no ionizados . El grupo fosfato, si el estado natural es ácido estará ionizado cuando queda libre el extremo 5’ esa es la orientación que le damos a la hebra de ADN , cuando no esta unido este grupo fosfato se llama nucleosido, Este tiene un enlace B-N- glucosídico que es covalente y se establece entre el carbono y el nitrógeno de la base nitrogenada . Al igual que las bases , los nucleosidos pueden sufrir modificaciones

Acidos nucleicos : contienen la información genética y son responsables de la información hereditaria . Están compuestos por  carbono , nitrógeno , hidrogeno , oxigeno y fosforo, Fueron descubiertos por Rosalin franklin

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En 1869 se hizo estudios en espermatozoides y leucocitos de salmón y se obtuvo una sustancia rica en C, H, O ,N , P y se le llamo nucleina. Años mas tarde se fragmento la nucleina y se separo en dos componentes uno proteico y uno acido ( ácidos nucleicos) ADN

Al igual que las proteínas tiene 4 estructuras , la primaria es solo el acido nucleicos como monohebra , tiene la información genética contenida en AGCT Como el primer nucleótido tiene el carbono 5’ y el siguiente nucleótido tiene libre el carbono 3’ se dice que la secuencia de nucleótidos se ordena de 5’3’ . En la estructura secundaria, que es donde ya se comienza a formar la doble hélice , se postulo en un principio 3 modelos para la imagen tridimensional del ADN en el A parecía que estaba muy pegado entre si , el Z era muy desordenado y el B es el que se acepta en la actualidad. ( ADN mamífero) El ADN tiene surcos con hendidura mayor de 22 Amstrong , una menor de 12 Anstrong y la vuelta de la hélice 34 amstrong conteniendo aproximadamente 10,5 pb.

La estructura terciaria consiste en que cada fibra de 20 angstroms se encuentra retocrida sobre si misma, formando una especie de super hélice ( topoisomerasas II  actividad ligasa nucleasa y ligasa) Este enrollamiento da estabilidad a la molécula y reduce su longitud. Procariotes: Súper hélice en forma generalmente circular y asociada a una pequeña cantidad de proteínas ( lo mismo ocurre en mitocondrias y en los plastos ) Eucariones: Empaquetamientos mas complejos y compactos, necesita HISTONAS y PROTAMINAS ( espermatozoides) El ADN de doble hélice se une a estas proteínas formando un octamero , es decir entre las proteínas histonicas están la H3 H4 2HA y 2HB 7 forman un nucleosoma que son conocidos como perlas o cuencas de cromatina , a su vez estas se empiezan a sobreenrollar y cuando hay 6 juntas se habla de nucleosoma empaquetado, esto se sigue sobreenrollando con ADN que quedan como dominios de Bucles , al seguir sobrenerollando nucleosomas con bucles forman espirales condensandas que

próximamente serán cromosomas en metafase ya que aquí se alinean n el ecuador de la cell para dividirse. La estructura cuaternaria , es la fibra de cromatina de 100 angstrom se empaqueta formando una de 300 . El enrollamienrto que sufre el conjunto de nucleosomas recibe el nombre de Solenoide. Los solenoides se enrollan formando la cromatina nucleo interfasico de la cell eucariota. Cuando la entra en división , el ADN se compacta mas, formando los cromosomas

del cell

Por biología molecular podemos marcar secuencias nucleotídicas con fluoróforos por FISH ( hibridación in situ con fluorescencia ) se puede hacer en sitios específicos del cromosoma como centrómero , telómero etc. o en los cromosomas completos como en el painting cromosómico. Modificaciones Histonicas También se pueden metilar , pero lo mas característico es que por enzimas HAT que son las histonas acetil transferasas transfiere grupos acetilos , entonces existen metilaciones o acetilaciones en las histonas . y ambas pueden estar asociadas a activación transcripcional o represión transcripcional . Cuando la cromatina esta compactada hay represión génica , pero hay algunas acetilaciónes generan el efecto contrario, en este caso una desestabilización de las cargas de la hebra y de las proteínas asociadas por lo tanto pueden estar mas compactadas porque interactúan con los grupos del ADN o pueden estar descompactadas produciendo activación transcripcional , esto va a depender de secuencias especificas de aa que determinan que una proteína sea una proteína , que pueda haber alguna variación en un aa y eso va a asociado al código genético degenerado. La ventaja es que dependiendo en que residuo aminoacidico se acetila la histona es el efecto que tiene. Esto se puede evidencia con un técnica de biología molecular como la precipitación de cromatina o con un PCR .

Cuando la cromatina se condensa o descondensa puede activar o reprimir la transcripción y es así como en el núcleo de la cell se dan los conocidos territorios cromosómicos, que son sectores donde se encontrara cromatina mas condensada y cromatina mas laxa , estos sectores se llaman factorías génicas. De aquí aparece la Eucromatina ( activos transcripcionalmente ) y heterocromatina ( inactoivos) Eucromatina es activo porque una secuencia de ADN en su caja TATA permite la llegada de por ejemplo un factor transcripcional como TAFs y con eso la llegada de los factores generales de la transcripción , la RNApol II y rio arriba hay enjancers y silenciadores que ayudaran a que se potencie o minimice la expresión génica ARN Existen distintos RNAm mensajero RNAr  ribosomal RNAt transferencia RNAno  nucleonar RNAsno pequeño nucleonar RNAmicro micro ARN Los microRNA modulan un monton de genes que se puede expresar o reprimir y hoy en dia se le investiga por ejemplo porque se ha visto que al modificar RNA las dosis de radiación necesarias para producir una terapia enun cáncer tienen que ser mucho menos cuando hay expresado y silenciado algún micro RNA caracteristicos. Al igual que el ADN tiene estructuras que se van caracterizando como la primaria secndaria y terciaria En la estructura primaria se refiere a secuencia de las bases nitrogenasas que constituyen sus nucleótidos , se diferencian del DNA por la Ribosa y y la timina por uracilo . es monocatenaria La estructura secundaria son pliegues de la monocadena que hace que la mismas bases del ARN comiencen a formar complementariedad y provoca por ejemplo los RNAt , Los extremos 5’ 3’ que mrcan el inicio y el final de la molecula permanecerán libres. La estrctra terciaria corresponde a un plegamiento complejo sobre la estructura secundaria adquiriendo una forma tridimensional. En la traducción hay varios RNA participantes , un RNA ribosomal que codifico para el ribosoma , un RNAm que es codificado mediante una secuencia génica que va servir como información para la síntesis de proteínas

Manipulación de los Ácidos Nucleicos Desde los 70’s la manipulación de los ácidos nucleicos ha sido con relativa facilidad, permitiendo realizar técnicas con mayor sensibilidad y especificidad, así como también nuevos descubrimientos. ¿Por qué y para qué manipulamos los ac nucleicos ? - Identificación de sus propiedades - Realización de técnicas de biología molecular: PCR, RT-PCR, PCR en tiempo Real, Southern Blot, RFLP,secuenciación , etc. - Modificación y/o combinación de fragmentos de DNA - Clonamiento, etc Uno de los factores críticos mas importantes es la Calidad del ácido nucleico de partida, por lo que la elección del método de extracción- purificación mas adecuado afecta directamente al éxito de la técnica posterior. Por ejemplo si quiero hacer secuenciación , necesito que el DNA este lo mas integro posible y esto va a depender de cómo lo manipulamos y tb de que muestra se extrae el material genético, no es lo mismo extraer desde un cultivo cell que un medio controlado o aislado que de un organismo completo. Preparativos para manipulación de ac nucleicos : Lo primero es CREAR UN AMBIENTE LIBRE DE NUCLEASAS , porque estas son enzimas que actúan principalmente degradando DNA como ARN por lo tanto el área de trabajo no puede ser cualquier tipo , este debería ser un lugar bajo campana , limpio previamente de nucleasas y se le aplica el tratamiento con luz ultravioleta también . -Organismos vivos producen varias enzimas diseñadas para degradar moléculas de DNA y RNA : DNAsas y RNAsas -Hay que minimizar los riesgos de exponer las muestras a este tipo de nucleasas( están en todas las superficies ) ¿Cómo crear un ambiente libre de nucleasas ? -Autoclavar soluciones y materiales de vidrio, metal, cerámica ( suficiente para eliminar DNAsas y RNAsas) - existen soluciones para eliminación de nucleasas ( RNAse away spray que se aplica un día antes y se deja actuar toda la noche) - Mantener los mesones limpios ( limpieza con soluciones de etanol 70% y/o soluciones especiales) - Material exclusivo para el trabajo con ácidos nucleicos ( pipetas, puntas, tubos de micro centrifuga, etc) todos libres de DNAsas/RNAsas. -Mantener material/ soluciones tapadas todo el tiempo que sea posible ( cuidado con el aire acondicionado) -SIEMPRE usar guantes. La piel produce RNAsa 7 , una potente enzima que degrada RNA -Trabajo con flujo unidireccional ( ejemplo PCR).

* El RNA es mas labil que el DNA. Cuidados especiales con el RNA -Las RNAsas son muy estables , no requieren cofactores, son muy efectivas en pequeñas cantidades y son difíciles de inactivar. -Lo ideal es eliminar las RNAsas, mas que inactivarlas, pero se pueden realizar medidas para minimizar la actividad de las RNAsas. Métodos para minimizar la actividad de las RNAsas . -Todo el material de plástico debe estar libre de RNAsas. (generalmente se usa vidrio , pero los ependorf son de plástico y se compran exclusivamente libres de DNAsas) - Utilización de puntas con filtro. -Tratamiento de soluciones, agua, material de vidrio con DEPC 0,1% . -Agua libre de RNAsas (tiocianato de guanidina, agentes reductores) -Trabajar rápido, mantener los tubos cerrados. - Usos de técnicas de asepsia: lugar físico libre de polvo, bacterias, esporas, etc. ( luz UV) -Apropiado manejo y almacenamiento de las muestras. -Guantes libres de polvo. ( emiten partículas de polvo que van a caer si o si en la muestra y la van a contaminar) Extracción y purificación de los Ácidos Nucleicos OBJETIVOS: -Mantener la integridad de los Ácidos Nucleicos -Ser lo mas eficiente posible - NO introducir sustancias contaminantes o inhibidores de reacción - Estabilizar los ácidos nucleicos para que no actúen las nucleasas Extracción : Sacar los componentes desde un compartimiento celular Involucra Lisis de las cell que contienen a los Ac Nucleicos  Inactivación de las nucleasas Separación de los Ac nucleicos de los restos celulares ( se puede hacer por métodos convencionales o kits comerciales) Purificación : separar ácidos nucleicos de otros componentes celulares contaminantes . - Proteínas solubles - Ácidos Nucleicos no deseados ( si quiero ADN debo sacar ARN y tb ARNasas) - Lípidos, Carbohidratos - Sales y compuesto orgánicos, etc.

Para la disgregación uno usa detergentes , por que la mb cell es lipídica. En la lisis es donde debemos meter todos los inhibidores de nucleasas y los protectores de ácidos nucleicos. El alcohol es un gran precipitante del material genético. Fuentes de ácidos nucleicos - cell de cultivos ( animales o bacterias) - Tejidos ( fresco o FFPE, fijado en formalina y embebido en parafina) - Fluidos Biológicos ( sangre, saliva, semen, orina, etc) - Muestras Forenses ( Hueso, pelo, etc) - Insectos - Plantas - Etc. La calidad de los ácidos nucleicos también depende de la calidad de la muestra de origen ( obtención, almacenaje y/o transporte son etapas críticas) 1.- HOMOGENIZACIÓN El procedimiento disgregación celular debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio( células o tejido) la delicadeza requerida para preservar las moléculas de interés ( DNA/RNA/Proteínas) Existen métodos de homogenización que son mecánicos y otros que son por ultrasonido. -METODOS FÍSICOS Y MECANICOS -METODOS QUÍMICOS Desde el nitrógeno liquido se va al mortero. Los métodos químicos son : -Detergentes -Proteasas -Agentes caotrópicos

La disgregación química es recomendable para bacterias, muestras pequeñas de tejidos frescos o sangre. En tejidos fibrosos es recomendable cortar en fragmentos pequeños para favorecer su disgregación .

2.- LISIS CELULAR PARA LA EXTRACCION Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen, permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la mb cell, así como inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN. Tanto la homogenización como la lisis celular son similares en los protocolos tradicionales y comerciales. METODOS QUIMICOS : HOMOGENIZAR/ LISIS CELULAR Solventes orgánicos: permeabilizan las mb cell disolviendo los componentes hidrofobicos de la pared . Ejemplo: cloroformo, tolueno. Álcalis: Producen saponificación de los lípidos de la mb. Es una técnica muy severa pero efectiva y de bajo costo, siempre y cuando el producto de interés sea resistente a la degradación a Ph elevados. Ejemplo: Hidróxido de sodio e hipoclorito Agentes Caotrópicos: interfieren con los enlaces no covalentes ( puentes de hidrogeno, fuerzas de van der Waals), desorganización la estructura del agua, haciéndola menos hidrofílica, debilitando las interacciones soluto-soluto. Ejemplo: urea , clorhidrato de guanidina. Detergentes: Forman micelas con los fosfolípidos de la bicapa lipídica, desestabilizando la mb y finalmente rompiéndola. La efectividad del método, radica en la química del detergente. Catiónicos sales de tetra-alquil-amonio, pH básico Aniónicos SDS, pH acido No anionicos  Triton X( es el mas usado)

ssuna hebra ds doble hebra

3 CLARIFICACIÓN Eliminación de restos celulares ( debris) -Centrifugación -Filtración -Método mixto: Enzimas ( proteasas, DNAsas, RNAsas) + Centrifugación -Salting-out: Precipitación de las proteínas y otros contaminantes con elevadas concentraciones de sales ( como el acetato amónico) quedando el DNA en disolución 4. PURIFICACIÓN  Métodos convencionales -fenol-cloroformo -Alcalino  Métodos comerciales ( fase solida) -Cromatografía de intercambio iónico -cromatografía de adsorción -Ultrafiltración -Partículas magnéticas -Kit de extracción de fase solida -Extracción de DNA desde un gel de agarosa. FENOL /CLOROFORMO A la muestra les agrego fenol / cloroformo e isopropanol que generan densidades distinta y el isopropanol se ocupa como precipitante del ADN/ ARN, y como este es menos denso que el fenol y cloroformo queda como sobrenadante. Todo lo que no nos sirve quedara abajo , este

sobrenadante se pasa a otro tubo que se ira limpiando con una serie de alcoholes que va a precipitar aun mas el material genético y finalmente se ocupa un buffer que por sus características provocara que precipite totalmente . Esto se puede disolver en agua o en el mismo buffer.

Este método se ocupa para extracción de plasmidos desde una bacteria.

Análisis Cualitativo en electroforesis en un gel de agarosa Análisis cuantitativo

Entrega la información de cuanto material genético se obtuvo de esa extracción , se expresa en nanogramos/ microlitro y esto nos permitirá por ejemplo , si se hace extracción de ARN para evaluar niveles de ARNm, se hace la extracción de ARN y depende de la cantidad que uno extrae la amplificación génica del PCR no se hace sobre el RNA , se debe convertir en DNA para poder hacer la amplificación . Se hace con una RT-PCR. cDNA  Es el complementario al ARN extraído Pero para hacer esta reacción se necesita una cantidad mínima de material extraído y que tenga...