Actividad Dirigida 1: El tilling PDF

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Grado: Biotecnología
Profesor: Juan José Camacho Cristóbal...

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El TILLING como herramienta prometedora en mejora vegetal INTRODUCCIÓN Actualmente, la mutagénesis aleatoria, ya sea natural o artificialmente inducida por el ser humano, es una herramienta esencial en mejora vegetal. El interés de los investigadores reside generalmente en la identificación de estas mutaciones o polimorfismos en el genoma, con el objetivo de averiguar su efecto funcional, así como su aplicación a la hora de mejorar las características fenotípicas de plantas de interés comercial. El punto central de este trabajo será la técnica de alto rendimiento llamada TILLING (Targeting Induced Local Lesion IN Genomes), que se ha vuelto muy popular como método de identificación de mutaciones individuales. El TILLING es una aplicación de la biología molecular que permite la detección directa de una mutación en un gen específico . Destinada principalmente a la mejora vegetal, esta técnica de genética reversa es no transgénica y, aunque ha sido desarrollada en Arabidopsis, también es de uso frecuente en otros organismos, como maíz, pez cebra, trigo, soja, tomate y lechuga. Esta técnica parte de inducir una mutagénesis química, generalmente con etilmetanosulfonato (EMS) o naranja de acridina, sobre un grupo de individuos (normalmente se emplean semillas como material de partida). Se trata de mutaciones puntuales que afectan a un solo nucleótido. Tras este protocolo, se identifica mediante un screening de ADN la presencia de mutaciones en el gen o los genes de interés con el objetivo de crear ventajas fenotípicas. El objetivo principal de este trabajo será analizar más a fondo la metodología y las aplicaciones de esta técnica.

METODOLOGÍA DEL TILLING Este método parte de la segunda generación (F2) de semillas mutadas por EMS o naranja de acridina, ya que la F1 puede contener plantas quimera, mientras que todas aquellas quimeras que hayan adquirido la mutación en la línea germinal generarán plantas mutantes al menos para un alelo. En concreto, el EMS es el agente mutagénico más empleado, y provoca cambios de pares GC a AT. Tras la inducción con este compuesto, se realiza un pool con el ADN de todos los individuos expuestos y, seguidamente, se realiza una PCR con primers diseñados para el gen de interés, normalmente marcados con fluoróforos. Como resultado, se obtiene el fragmento del gen de interés amplificado de las plantas. Estos fragmentos serán los llamados homodúplexes, ya que estarán constituidos por la hibridación de dos hebras mutantes o de dos hebras WT, según la planta. Para poder obtener información sobre la mutación, el TILLING se basa en la generación de heterodúplexes. Para ello, se realiza una mezcla de todos los homodúplexes anteriores, que son desnaturalizados por calor para seguidamente ser enfriados gradualmente ( renaturalización). Como consecuencia, algunas hebras con el alelo mutante hibridarán con hebras con el alelo silvestre, ocasionando la formación de heterodúplexes, que contendrán un desapareamiento o mismatch en su secuencia.

Gracias al mismatch que contendrán los heterodúplex obtenidos, podemos detectar y caracterizar estos híbridos de distintas formas, entre las que destacamos: 

Denaturing-HPLC: método complejo que emplea un gradiente de temperatura y permite separar por tamaño las moléculas gracias a las diferencias en su velocidad de desnaturalización, que será mayor a más desapareamientos contengan.



Endonucleasas de cadena simple: las endonucleasas de cadena simple (como CEL I) cortan el ADN en el punto de desapareamiento, lo cual permite separar los fragmentos por tamaño en un gel de electroforesis. La limitación de esta técnica es que esta enzima es poco específica, por lo que deben marcarse los primers con fluoróforos a la hora de analizar el patrón de bandas.

Una vez detectados los mutantes, es necesario volver a la población inicial y estudiar cada muestra individualmente. Para esto, se mezcla el genómico de un individuo con el del silvestre. Sólo encontraremos heteroduplex si el individuo es mutante. Para averiguarla localización física de la mutación, tendremos que realizar un mapeo de mutaciones. Hay que tener en cuenta que los desapareamientos pueden ser originados por la mutación, pero también por heterogeneidad genética en un mismo individuo o variaciones naturales entre distintos individuos de la misma especie. MAPEO DE MUTACIONES

Ya vimos que una de las aplicaciones más interesantes de los marcadores moleculares era el mapeo de mutaciones. Imagina, por ejemplo, que encontramos un nuevo mutante tb1-like a partir de la línea B73 de maíz. ¿Cómo se puede averiguar la localización física de la mutación? Pues cruzando los individuos mutantes con otra línea distinta de maíz en la que existan polimorfismos comunes a la B73 que sean detectables por marcadores. En este caso los vamos a cruzar con la línea Mo17 (la F2 se obtiene por retrocruzamiento de la F1, dando ¾ normales, ¼ mutante):

Hecho esto ¿Cómo podemos averiguar la localización física de dicha mutación? Para empezar, debemos tener un marcador(es) que nos permita distinguir los individuos de las dos líneas. Imagina que tenemos 3: E, F y G. Lo siguiente que hay que hacer es estudiar si esos marcadores están o no ligados a la mutación. Como los marcadores están localizados físicamente, si alguno está ligado a la mutación, eso querrá decir que está cerca de ésta y por ello se heredan siempre juntos. Para estudiar el ligamiento del marcador a la mutación, tenemos que partir de los individuos mutantes homocigóticos de la F2 (tb 1-20). Si la mutación tb de B73 está muy ligada al marcador, esperaríamos encontrar el polimorfismo de B73, ya que se ha heredado la mutación junto con el fragmento del cromosoma que contiene el marcador. E y F= marcadores, X= mutación,

= posible recombinación

Mucha ligación: casi todas las que hereden X, heredarán E. Tanto en 1 como en 2. B73

1 2 ------------E---X-----------------

Mo17----

-----e----------

---------

Si un marcador está muy ligado a la mutación, los individuos homocigóticos para la mutación (XX) tras el cruce de las dos líneas (F2) serán mucho más propensos a heredar el polimorfismo de la especie mutada (en este caso B73, el polimorfismo E).

Poca ligación: habrá plantas que hereden F y X (1) y también f y X (2). B73

1 2 -------------F---------------X-----

Mo17----

------f------ --------------

Si un marcador está poco ligado a la mutación, los individuos homocigóticos para la mutación (XX) tras el cruce de las dos líneas (F2) serán tan propensos a heredar un polimorfismo del marcador como el otro. Es decir, habrá más o menos el mismo número F que f.

¿Cómo podemos hallar la distancia entre el marcador y la mutación? Si el organismo es diploide, habrá plantas FF, ff y Ff. Las ff tendrán 2 cromosomas recombinantes, las Ff sólo uno y las FF ninguno. En el ejemplo, encontramos 20 cromosomas recombinantes de 40 cromosomas totales. Esto hace un 50%, que equivale a 0,5 morgans de distancia (50 cM o 50 unidades de mapa). Éste es el valor máximo, o ya empezaría a considerarse ligado a e y eso no puede ser. Ejercicios

MUTANTES INSERCIONALES La transformación con Agrobacterium se puede utilizar para crear mutantes knock-out: mutagénesis insercional. Esto consiste en que las plantas se transforman con un T-DNA que lleva un gen marcador (p.e. kanamicina) flanqueado por dos regiones (LB y RB) que permiten su integración en el genoma. El propósito de esta técnica es eliminar la actividad de un gen con el objetivo de determinar la función de dicho gen.

La generación de mutantes insercionales por T-DNA tiene 4 pasos: 1. 2. 3. 4.

Transformación con Agrobacterium tumefaciens. Selección de los transformantes con kanamicina. Identificación de la inserción. Obtención de mutantes homocigóticos.

Como vemos en el paso 3, es necesario comprobar el lugar exacto en el que se ha insertado el tDNA. Para ello, tenemos dos opciones: 

Primer específico del T-DNA. Podemos poner un primer dentro del tDNA (por ejemplo en el LB) y otro aleatorio (que hibridará en algún punto del genoma) y amplificar el genoma de la planta. Los productos de amplificación se purifican, se clonan y se secuencian. Finalmente se comparan informáticamente con el genoma y los alineamientos nos dirán dónde está.



Digestión con enzimas. Se corta dentro del t-DNA y fuera de éste aleatoriamente con la misma enzima. Se favorece la religación y por PCR inversa se amplifica el “plásmido” que ha resultado. El producto de PCR se purifica, se clona y se secuencia y se concluye de igual manera que en el caso anterior.

Existen bases de datos (como tair, que es una base de Arabidopsis), donde podemos buscar directamente los mutantes de inserción con su localización, sus exones y todo. La información más interesante, además de poder pedir la semilla de cada mutante homocigótico knock-out, es la secuencia que se ha obtenido del lugar donde está insertado el t-DNA. Si a esa secuencia le hacemos un blast con el genoma de Arabidosis, debería hibridar en el gen que se ha silenciado por inserción. Con esto podemos averiguar no sólo en qué gen se inserta, sino en qué punto de ese gen. Así, una vez que conocemos la localización exacta, podemos diseñar los primers que amplifican en las regiones flanqueantes y caracterizar los mutantes para saber si son homocigóticos o heterocigóticos para la inserción.

A continuación vemos cómo se hace:

Gen Cax3 tDNA-----------------|-------------------------------------M1 P1

-----------------------------|------------------

P1/M1 (sólo hay banda en el alelo mutante) P1/P2 (sólo hay banda en el alelo silvestre)

------------|-----------------------------------------

P2

Con ambos juegos se primers: -

Un mutante homocigótico sólo presentará banda con el segundo par. Un WT homocigótico sólo presentará banda con el primer par. Un heterocigótico presentará banda en ambos casos.

También se puede jugar en una sola PCR con los 3 primers: -

Un mutante homocigótico presentará una banda pequeña. Un WT homocigótico sólo presentará una banda grande. Un heterocigótico presentará las dos bandas.

DISEÑO DE PRIMERS Se coge la secuencia, se mete en el programa y se le pide que nos diseñe un par de primers con la salvedad de que no hibriden en la secuencia correspondiente al t-DNA, o que uno sí y otro no. Ten en cuenta que un primer es la directa igual y otro la reversa complementaria....