Algunas Propiedades Fisícas de las Proteínas PDF

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Reporte No. 3 Bioquímica I...

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PRÁCTICA No. 3 ALGUNAS PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS PROTEÍNAS Departamento de Bioquímica, Facultad de ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala, Carrera de Química Biológica. INTRODUCCIÓN Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo y realizan una enorme cantidad de funciones diferentes. Las proteínas se sintetizan dependiendo de cómo se encuentren regulados los genes que las codifican. Por lo tanto son susceptibles a señales o factores externos los cuales pueden cambiar sus estructuras (Nelson & Cox, 2011). Los objetivos principales en esta práctica fueron determinar experimentalmente el punto isoeléctrico de la caseína por variaciones de pH y provocar la desnaturalización de la α-amilasa y la caseína, inducida por distintos agentes químicos y físicos, demostrando el proceso que causa un cambio estructural de las proteínas donde pierden su estructura nativa, y de esta forma cambian sus propiedades físico-químicas en algunos casos y pierden su óptimo funcionamiento (Van Holde, Mathews & Ahern, 1996). El proceso de desnaturalización se demostró por medio de la reacción de Biuret la cual indicó que la estructura de la caseína no se vio afectada. Al desnaturalizar la α-amilasa se comprobó que sí afectó su funcionamiento. Lugol la cual comprueba la presencia de METODOLOGÍA carbohidratos (BBS, 2015). El punto isoeléctrico de una proteína es generalmente el pH en el cual tiene la menor solubilidad. El PI de la caseína se encontró por RESULTADOS variaciones de pH, utilizando sulfato de cobre Gráfica 1 Comparación en la formación de para precipitar en forma aniónica y precipitados de caseína a distinto pH. wolframato de sodio para precipitar en forma catiónica (Value Amrita, 2011). La desnaturalización de las proteínas ocasiona la pérdida de su estructura nativa, el cambio de sus propiedades físico-químicas y la pérdida de su función biológica. La desnaturalización puede ser inducida por agentes físicos y químicos como la temperatura y el pH del medio (Van Holde, Mathews & Ahern, 1996). Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de Se sometió a la caseína a distintas condiciones Bioquímica, edificio T-12, USAC para demostrar la desnaturalización con la Comparación en la adición de sulfato de cobre reacción de Biuret la cual indica si hay y wolframato de potasio a distinto pH. presencia de proteínas (Value Amrita, 2011). La α-amilasa es una enzima la cual ayuda a digerir el almidón y otros carbohidratos, al Tabla 1. Soluciones de caseína a diferentes desnaturalizarla cambia su estructura por lo pH que pierde su función biológica, comprobando No. Concentraciones Concentración pH la pérdida de esta función con la prueba de Tubo de CH₃COOH** de Na+ CH₃COO-

*** 1

0,002N

0,04N

6.04

2

0,005N

0,04N

5.64

3

0,01N

0,04N

5.34

4

0,02N

0,04N

5.04

5

0,04N

0,04N

4.74

6

0,08N

0,04N

4.44

7

0,16N

0,04N

4.14

8

0,32N

0,04N

3.84

9

0,04N

0,04N

3.74

Soluciones de caseína a diferentes pH Fuente: Datos experimentales, obtenidos en el Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12, USAC. *N= normalidad, **CH₃COOH= ácido acético ***Na+CH₃COO-= acetato de sodio. En la tabla 1 podemos ver la medida de pH de la solución de cada tubo dependiendo de la concentración y volumen de ácido acético añadido a la solución.

Tabla 2. Desnaturalización de la caseína determinada por prueba de Biuret No. Tubo

Prueba Biuret

Observaciones

1. HCl

**-

líquido incoloro con partículas en suspensión blancas

2. NaCl

*+

liquido traslucido color púrpura

3. NaOH

+

liquido traslucido color púrpura

4. Calenta do a 80º

+

liquido traslucido color púrpura

PI*** caseina

4.6-4.8

Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de Bioquímica, edificio T-12, USAC * + = positivo a la prueba de biuret **- negativo a la prueba de biuret *** Punto isoelectrico En la tabla 5 se describe la desnaturalización de la caseína y resultado al añadirle distintas soluciones comprobando el mismo con la prueba de Biuret.

Tabla 3. Desnaturalización de la amilasa determinada por la prueba del lugol Tubo*

Prueba del Lugol

Observa ciones

A:1 mL de agua destilada 5 mL de almidón 1%

+

Solución morada

B:1 mL de solución de amilasa diluida 5 mL de almidón 1%

-

Solución morada

C:1 mL de solución de amilasa diluida y 10 gotas de HCl concentrado 5 mL de almidón 1%

+

Solución azul

Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de Bioquímica, edificio T-12, USAC + positivo a prueba con lugol - negativo a prueba con lugol *Descripción del contenido de la solución de cada tubo. En la tabla 6 se describe la desnaturalización de la amilasa con un control y resultado al realizar la prueba del lugol.

DISCUSIÓN Uno de los métodos de separación de proteínas consiste en hacerlas interactuar con cationes de metales o cationes de ácidos para que el compuesto resultante precipite (Quesada, 2007) en el punto isoeléctrico de la proteína poseen carga 0 y en el caso de la caseína el punto isoeléctrico teórico es de 4.60 (A.A.P.P.A.,2004) al estar en una solución de acetato de sodio se tiene carga negativa y esta reacciona con aniones ácidos. Al agregar el ácido acético en bajas concentraciones en el tubo del 1 al 5 (Tabla 1) se encontró en un pH por arriba de su punto isoeléctrico y al

agregar una concentración mayor de ácido acético en el tubo 6 al 9 disminuyó el pH por debajo del punto isoeléctrico, dando un producto que es insoluble en la solución y precipita. Si una proteína con carga negativa reacciona con un catión (ion positivo), se forma una sal que precipita y si una proteína con una carga positiva reacciona con un anión (ion negativo), también se forma una sal insoluble. (Quesada, 2007) Al comparar el punto isoeléctrico teórico con el experimental que fue de 4.59 (Cálculo 1) el resultado fue muy cercano al teórico por lo que la limitante pudo ser que no fue tomado por un método directo como el de electroforesis para separar especies con carga en un campo eléctrico (Bailey y Bailey, 1998) La reacción de Biuret es un método general para la determinación de proteínas basada en la reacción del sulfato de cobre en un medio alcalino, esta prueba va dar un resultado positivo siempre y cuando haya por lo menos 2 ó más enlaces peptídicos, manifestándose por una coloración violeta (Quesada, 2017). Para las diferentes disoluciones (Ver tabla No. 2) se obtuvieron resultados positivos para las disoluciones de caseína en NaCl, NaOH y calentada hasta una temperatura de 80 C, esto es debido a la formación de un compuesto de coordinación entre el reactivo de biuret y los electrones no apareados del nitrógeno en los enlaces peptídicos de la de la caseína. La caseína es una proteína que se encuentra en la leche, la que normalmente tiene un ph entre 6.5 a 6.7, por lo tanto para que la caseína este en su forma funcional debe estar presente en forma Aniónica, es por esto que en estas soluciones se obtuvo un resultado positivo, porque al ser medios básicos no alteran el ph funcional básico de la caseína. Por el contrario al agregar HCl a la solución con caseína (Ver Tabla No 2) se obtuvo un resultado negativo, esto debido a la alteración

del medio de pH funcional de la caseína, provocando que esta llegue a su punto isoeléctrico (Ver tabla No 2), provocando esto la protonación de los grupos fosfato y consecuentemente la precipitación de la caseína, la cual se pudo comprobar mediante la observación de partículas en suspensión blanca del tubo No 1 (Ver tabla No 2). Se realizó la prueba de lugol, para comprobar la funcionalidad de la enzima alfa- amilasa, en el caso del tubo A (ver tabla No.3), se obtuvo un resultado positivo para la prueba de lugol, el cual es comprobado mediante la visualización de una coloración morada en la solución, esto fue debido a que el yodo del reactivo de lugol se introduce dentro de los espirales de la molécula de almidón, comprobando esto que el almidón es su forma estable y funcional se encuentra plegada. En el caso del tubo B (Ver tabla No.3), se obtuvo un resultado negativo, esto fue debido a que al agregarle la alfa- amilasa, la cual tiene la característica de provocar hidrólisis, esta rompe los enlaces del almidón, por lo tanto ya no hubo enlaces para que el yodo se introduzca y forme el color morado característico de esta prueba. Para el tubo C, se obtuvo un resultado positivo para la prueba de lugol( Ver tabla No.3), esto debido a que el pH al que la amilasa cumple su función de hidrólisis es de 7 (Guarnizo y Martínez, 2009), y al agregar HCl, se creó un ambiente hostil para la enzima provocando de tal manera la desnaturalización y por tanto su pérdida de función, permitiendo que el almidón conserve su forma plegada y por tanto permitiendo que el yodo se introduzca en sus hélices dando formando la coloración morada característica de la prueba antes mencionada.

CONCLUSIONES: 1. La caseína presentó un punto isoeléctrico de 4.59 2. La prueba de Biuret presentó un resultado positivo en los medios alcalinos debido a que no altera la función biológica de la caseína. 3. La prueba de Biuret presentó un resultado negativo en el medio ácido debido a la protonación de los grupos provocando la precipitación de la caseína. 4. La alfa-amilasa pierde su capacidad de hidrolizar el almidón en un pH menor a 7 debido a que en medio ácido se desnaturaliza. 5. El cálculo del punto isoeléctrico pudo ser afectado por no utilizar un método directo

REFERENCIAS A.A.P.P.A. (2004). Introducción a la tecnología de alimentos.México: Editorial LIMUSA. Bailey,S., Bailey,A. (1998). Química orgánica: concepto y aplicaciones. México:Editorial Pearson. Guarnizo, A., Martinez,P. (2009). Experimentos de química orgánica:con enfoque en ciencias en la vida.Colombia:Ediciones Elizcom. Value Amrita. (2011). Isoelectric Precipitation of Proteins: Casein from Milk. Recuperado de http://vlab.amrita.edu/? sub=3&brch=63&sim=158&cnt=1 Nelson, D. & Cox, M. (2011). Lehninger Principios de Bioquímica. España: Editorial Omega.

Brilliant Biology Student. (2015). Iodine Test for Starch. Recuperado de http://brilliantbiologystudent.weebly. com/iodine-test-for-starch.html Quesada, S. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para Bioquimica. Costa Rica: EUNED. Van Holde, K., Mathews, C. & Ahern, K. (1996). Bioquímica. México: Pearson Educación

ANEXOS Calculo 1. Determinación de punto isoeléctrico experimental pI= (pH1 +pH2) /2 = (4.44+4.74)/2= 4.59 Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de Bioquímica, edificio T-12, USAC

Figura 1 Cálculos de la concentración del ácido por cada tubo C2=(C1*V1) /V2 C2= concentración del ácido por cada tubo C1= concentración de ácido acético añadido V1= volumen de ácido acético añadido V2= volumen total 1. (0.04*0.50) /10=0.002 2. (0.04*1.25) /10=0.005 3. (0.4*0.25) /10=0.01 4. (0.4*0.50) /10=0.002 5. (0.4*1) /10= 0.04 6. (0.4*2) /10=0.08 7. (0.4*4) /10=0.16 8. (0.4*3) /10=0.32 9. (4*1) /10=0.4

Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de Bioquímica, edificio T-12, USAC

Figura 2 Cálculo de la concentración de acetato de sodio C2=(C1*V1) /V2 C2= concentración de acetato de sodio C1= concentración de ácido acético añadido V1= volumen de ácido acético añadido V2= volumen total (0.4*1)/10 = 0.04 pI= (pH1 +pH2) /2 = (4.44+4.74)/2= 4.59 Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de Bioquímica, edificio T-12, USAC

Figura 3 Cálculo del pH por tubo pH= pKa + log (A1/A2) A1=concentración de ácido acético añadido A2=concentración de ácido acético calculado por cada tubo 1. 6.74 + log(0.04/0.002)= 8.04 2. 6.74 + log(0.04/0.005)= 7.64 3. 6.74 + log(0.4/0.01)= 7.34 4. 6.74 + log(0.4/0.02)= 7.04 5. 6.74 + log(0.4/0.04)= 7.74 6. 6.74 + log(0.4/0.08)= 6.43 7. 6.74 + log(0.4/0.16)= 6.13 8. 6.74 + log(0.4/0.32)=5.83 9. 6.74 + log(4/0.4)= 5.74 Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de Bioquímica, edificio T-12, USAC...