biochemia kolokwium zasasy azotowe dna rna PDF

Preview

Summary

na kolokwium notatki...

Description

Zasady azotowe: organiczne związki heterocykliczne, formalnie pochodne puryny lub pirymidyny tworzące razem z deoksyrybozą i fosforanem nukleotyd. Nici kwasów nukleinowych mogą wiązać się ze sobą zasadami azotowymi w pary zasad poprzez wiązania wodorowe i koordynacyjne. Sekwencja nukleotydów (kolejność występowania zasad) w kwasach nukleinowych to kod, czyli sposób zapisu informacji genetycznej o kolejności aminokwasów w białkach.

Zasady purynowe:  Cytozyna  Tymina  Uracyl Zasady pirymidynowe:  Adenenina  Guanina

Nukleotyd: Zbudowane są z reszty cukrowej – pentozy (w DNA jest to deoksyryboza, zaś w RNA – ryboza), co najmniej jednej reszty fosforanowej i zasadyazotowej: purynowej, pirymidynowej lub flawinowej(niewystępując ej w kwasach nukleinowych). Grupa fosforanowa formuje wiązanie z 2, 3 lub 5 węglem w pierścieniu pentozowym. Najbardziej rozpowszechnione jest wiązanie pomiędzy fosforanem a węglem 5. Nukleotydy cykliczne formują się, gdy dochodzi do połączenia grupy fosforanowej z dwiema grupami hydroksylowymi reszty cukrowej.

Zasada heterocykliczna

Nukleozyd

Deoksynukleozyd

adenina

adenozyna A

deoksyadenozyna dA

guanina

guanozyna G

deoksyguanozyna dG

tymina

5-metylourydyna m5U

tymidyna T

uracyl

urydyna U

2'-deoksyurydyna dU

cytydyna C

deoksycytydyna dC

cytozyna

DNA: DNA ma postać heliksu (inaczej "podwójnej helisy"). Zbudowane jest z

deoksyrybonukleotydów. W skład pojedynczego deoksyrybonukletydu wchodzą: - zasada azotowa: adenina lub guanina (dwupierścieniowa puryna), cytozyna lub tymina (jednopierścieniowa pirymidyna) - 2-deoksyryboza (pentoza), - reszta fosforanowa. Zasada azotowa połączona jest z pierścieniem pentozowym cukru wiązaniem Nglikozydowym. Natomiast deoksyrybonukletydy połączone są ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi. Wiązanie te występuje pomiędzy atomem 5’ węgla w reszcie cukrowej jednego deoksyrybonukleotydu, a atomem 3’ reszty cukrowej drugiego. Deoksyryboza jest pochodną rybozy, w której grupa hydroksylowa połączona z węglem 2' zastąpiona jest grupą wodorową. Grupa fosforanowaskłada się z jednej, dwóch lub trzech reszt fosfor Forma B-DNA Postać B uważana jest za główną, najczęściej pojawiającą się formę DNA w warunkach fizjologicznych. Wystąpieniu tej formy sprzyjają takie warunki jak: małe stężenie soli i duży stopień hydratacji. Wielkość skoku w formie B wynosi 3,4 nm na każdy zwój. Z kolei, na każdy skręt cząsteczki B-DNA przypada 10 par zasad. Jednakże, jak wynika z różnorodnych badań, liczba par zasad przypadających na skręt może się zmieniać między 10,0-10,6 pz. Forma A-DNA Odmianą struktury B, jest forma A-DNA. Powstawaniu tego rodzaju cząsteczki DNA sprzyja środowisko bardziej bogate w jony Na+ i K+, a także mniej uwodnione niż w przypadku BDNA. Forma A-DNA jest prawoskrętna, a jej cząsteczka zajmuje więcej miejsca w porównaniu do B-DNA. Jest to spowodowane tym, że w cząsteczce tej na jeden skręt przypada więcej par zasad. Forma ta przypomina strukturę dwupasmowego RNA i podwójnego hybrydu DNA-RNA . Formy C, D, E-DNA Prawoskrętne są także formy C-E DNA. Są one obserwowane w bardzo swoistych warunkach doświadczalnych. Według przeprowadzonych badań sądzi się, że formy te nie istnieją in vivo, tylko w warunkach doświadczalnych

RNA: Wśród kwasów rybonukleinowych wyróżnia się między innymi:  informacyjny lub matrycowy RNA (mRNA) : to matrycowy czyli informacyjny RNA przenosi on przepisaną informację genetyczną z DNA występującego w jądrze komórkowym do cytoplazmy na rybosomy. Jest to konieczne, gdyż DNA nie może opuszczać jądra komórkowego.  rybosomalny RNA (rRNA) : przenosi znajdujące się w cytoplazmie aminokwasy na rybosomy;  transferowy RNA (tRNA) : przenosi znajdujące się w cytoplazmie aminokwasy na rybosomy;

Cząsteczki RNA są jednoniciowe. Nukleotydy budujące nić RNA zawierają:

- resztę kwasu fosforowego, - cukier pięciowęglowy zwany rybozą, - zasady azotowe np.: adeninę (A), guaninę (G), cytozynę (C), uracyl (U) zamiast tyminy. Biorąc pod uwagę rolę jaką odgrywa RNA w syntezie białka wyróżniamy: - mRNA - tRNA to transportujący RNA -- rRNA t przenosi znajdujące się w cytoplazmie aminokwasy na rybosomy; Metody izolacji RNA Procedury izolacji RNA podobne są do izolacji DNA. Opierają się one na lizie i homogenizacji komórek w środowisku, w którym rybonukleazy są szybko denaturowane. Następnie przeprowadza się ekstrakcję fenolowochloroformową i precypitację. W ten sposób otrzymuje się całkowity RNA komórki. Można je wykorzystać bezpośrednio do dalszych doświadczeń lub poddać rozdziałowi na różne frakcje. W celu dalszego oczyszczenia surowego preparatu RNA stosuje się deoksyrybonukleazy trawiące pozostałości DNA, a resztki białek można usunąć przez stosowanie proteaz (np. proteinazę K). Uzyskany preparat może zawierać śladowe ilości rybonukleaz, dlatego nie nadaje się do długiego przechowywania. Trwałość można zwiększyć, zamrażając próbki w ciekłym azocie lub w temperaturze rzędu od −70 do −80 °C. Ekstrakcja dwufazowa Po dezintegracji komórek przeprowadza się ekstrakcję RNA roztworem składającym się z fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego w stosunku objętościowym 25:24:1. Powstają dwie fazy – wodna i organiczna. RNA gromadzi się w fazie wodnej. Odczyn fenolu musi być buforowany do odpowiednio kwaśnego poziomu, ponieważ wtedy DNA ulega ekstrakcji do fazy organicznej lub pozostaje w międzyfazie wraz ze zdenaturowanymi białkami. Z wodnej fazy RNA wytrącany jest przez dodanie etanolu lub izopropanolu, po czym mieszaninę wiruje się, a produkt uzyskuje się w postaci niewielkiej ilości zbitego ciała stałego na dnie probówki. Jednostopniowa metoda izolacji RNA (AGPC) Obecne najpopularniejsza metoda izolacji RNA bazuje na ekstrakcji fenolowochloroformowej z użyciem soli chaotropowych (np. tiocyjanianu lub chlorowodorku guanidyny). Metoda ta, nazywana AGPC. Sole chaotropowe denaturują białka (odbiałczają), ułatwiają rozpad błon komórkowych i są silnym inhibitorem rybonukleaz. W klasycznej metodzie AGPC lizę komórek przeprowadza się w roztworze zawierającym tiocyjanian guanidyny, sarkozyl (detergent), β-merkaptoetanol (usuwa mostki dwusiarczkowe) oraz cytrynian sodu do regulacji pH. Następnie do lizatu dodawane są bufor octanowy o pH 4,0 (złożony z octanu sodu i kwasu octowego), fenol nasycony wodą i mieszanina chloroformu z alkoholem izoamylowym. RNA znajduje się w fazie wodnej i jest następnie wytrącany izopropanolem lub etanolem.

Użycie detergentu Nonidet P-4

Cytoplazmatyczny mRNA można wyizolować, stosując niejonowy detergent Nonidet P-40 lub jego zamiennik. Zaletą tej metody jest to, że jądro komórkowe pozostaje nienaruszone, a tym samym istnieje możliwość wyizolowania dodatkowo DNA. RNA zawarte w roztworze można oczyszczać, stosując ekstrakcję fenolowo-chloroformową.

Ocena jakościowa i ilościowa ekstraktów RNA Metoda elektroforetyczna: Za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym można rozdzielić kwasy nukleinowe według wielkości. Pod wpływem przyłożonego napięcia ujemnie naładowane grupy fosforanowe przemieszczają się w stronę dodatniej anody, a mniejsze fragmenty migrują przez żel szybciej niż większe. Rozdział ten musi przebiegać w warunkach denaturujących, ponieważ RNA ma tendencję do tworzenia skomplikowanych struktur drugo- i trzeciorzędowych, które zaburzają migrację RNA w żelu. W tym celu najczęściej stosuje się formaldehyd, formamid lub glioksal

Metoda spektrofotometryczna Spektrofotometryczny pomiar absorbancji wykonuje się przy długości fali 260 nm (maksimum absorpcji dla DNA, RNA) oraz przy 280 nm (maksimum absorpcji dla białek). Obecnie metody izolacji można podzielić na 3 główne grupy: 1) Izolacja DNA z zastosowaniem mieszaniny fenol: chloroform( stosowane do odbiałczania preparatów) 2) Izolacja DNA, która przebiega z wysoleniem białek z otrzymanych lizatów komórek 3) Izolacja DNA z wykorzystaniem odpowiedniego nośnika, do którego DNA będzie się wiązać, następnie odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie związanego DNA...