Biochemie Praktikum - Versuche 2-6 PDF

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Versuche 2-6...

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Protokoll zum Praktikum in Biochemie

II. Biologische Phosphorsäure- und Schwefelderivate

Vom 3.11.2012

I.

Einleitung

Sowohl Schwefel als auch Phosphor haben eine essentielle Bedeutung für Biomoleküle aller Art. Phosphor macht in der Trockenmasse des Menschen etwa 4% aus, und findet sich vor allem in DNA und RNA sowie ATP, ist aber auch essentiell für das pH-Puffersystem des Blutes. Da direkte Phosphatnachweise schwierig und recht Störanfällig sind, wird im Rahmen dieses Praktikums ein indirekter Phosphornachweis in Form eines DNA-Nachweises, genauer, dem Nachweis der Desoxyribose, einem Baustein der DNA durchgeführt. Schwefel hat sein Vorkommen vor allem in Proteinen im Menschlichen Körper, er ist Bestandteil der Aminosäuren Cystein und Methionin und ermöglicht durch Disulfidbrücken stabile Tertiärstrukturen in Proteinen und Coenzymen. Wichtig ist Schwefel auch durch seine Eigenschaft Übergangsmetallsulfide (vor allem mit Eisen) zu bilden, die vor allem in den aktiven Zentren von Enzymen zentrale Bedeutung haben.

II.

Methoden

1. Phosphornachweis durch Desoxyribosenachweis In diesem Experiment wird zunächst eine Eichgerade mit bekannten Konzentrationen von Desoxyribose erstellt, anhand derer die Desoxyribosekonzentration der DNA bestimmt werden kann. Um die Desoxyribose freizusetzen, die zu Beginn in der DNA gebunden vorliegt, wird eine saure Hydrolyse durchgeführt, bei der die mit den Purinbasen verknüpfte Desoxyribose frei wird. Diese Ribosen werden mit dem Dische-Reagenz versetzt, das sich mit Ribosen zu einem blauen Komplex verbindet, sodass mittels Extinktionsmessung die Konzentration bestimmt werden kann. 1.1 Erstellung der Eichgeraden In einer Doppelbestimmung wurden zwei mal Schraubdeckel-Eppendorfgefäße mit je 0,5,10,20,30,40,50 und 75 µl Desoxyribose (1mg/ml in Bidest-Wasser) Pipettiert, mit Wasser auf 300 µl aufgefüllt und mit 700 µl Dische-Reagenz versetzt. Nachdem diese Proben 10 Min. bei 100°C inkubiert wurden, um die Komplexbildung zu beschleunigen, wurde mittels einer Extinktionsmessung bei 598 nm eine Eichkurve erstellt und auf mm-Papier festgehalten. 1.2 Desoxyribosebestimmung der Lösung mit unbekannter DNA Für eine Doppelbestimmung wurden zwei Schraubdeckel-Eppendorfgefäße mit je 150 µl der Fisch-DNA, 150 µl Trichloressigsäure (20%), sowie eine Referenzprobe mit 150 µl Wasser und 150 µl TCA befüllt, gut durchmischt und für 45 min. bei 100°C inkubiert. So kommt es zu einer Denaturierung des DNA-Stranges und die Desoxyribose, die mit Purinbasen verknüpft war, wird frei. Nach dieser Zeit wurden 700 µl Dische-Reagenz zugegeben und weitere 10 Min. bei 100°C inkubiert, um eine Komplexbildung zu beschleunigen. Nach dem Erkalten der Probe wurde die Extinktion bei 598nm gegen die Referenzprobe gemessen. Anhand der Eichkurve kann nun der Desoxyribosegehalt ermittelt werden. 2. Enzymatische und nicht-enzymatische Umsetzung des Schwefelderivates Glutathion

Glutathion-S-Transferase ist ein Enzym, das die Bindung von Glutathion an organische Verbindungen katalysiert. In diesem Versuch soll die Kinetik dieser Reaktion mit und ohne Enzym mittels Extinktionsmessung untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden in zwei Küvetten je 880 µl H2O, 100 µl Reaktionspuffer (1M Kaliumphosphatpuffer pH 6,5), 10 µl CDNB (Dinitrochlorbenzol, 100mM in EtOH) und 10 µl GSH(Glutathion-Lsg, 100mM) pippetiert. In eine Küvette wurden zusätzlich 10 µl des Enzyms pippetiert, und anschließend für 3 min. alle 10 Sek. bei 340nm die Extinktion gemessen.

III.

Auswertung

1. Phosphornachweis durch Desoxyribosenachweis Die Extinktion der beiden Doppelbestimmungen sind 0,342 und 0,366, als Mittelwert ergibt das 0,354 Daraus ergibt sich beim Auslesen aus der Kallibriergeraden eine Desoxyribosekonzentration von etwa 16 µg Desoxyribose. Da nur die Desoxyribose der Purinbasen verfügbar ist, die tatsächliche Menge an Desoxyribose ist also doppelt so groß und damit 32µg/150µl Daraus ergibt sich eine Konzentration von 0,738mg/ml 2. Enzymatische und nicht-enzymatische Umsetzung des Schwefelderivates Glutathion Bei der enzymatischen Umsetzung lag die Extinktion zu Beginn bei 0, nach 3 Minuten bei 0,468 Bei der nicht-enzymatischen Umsetzung beginnt der Reaktionsverlauf ebenfalls bei einer Extinktion von 0, steigt aber nur bis zu einem Wert von 0,028, daraus ergibt sich eine Steigung von 0,156/min für die enzymatische und 0,0093/min für die nicht-enzymatische Reaktion, d.h. die enzymatische Reaktion ist etwa 16,71mal schneller als die nichtenzymatische.

Die aus den durch die photometrischen Messungen erhaltenen Werten gebildete Eichgerade

Abb. 1: Kallibrierkurve der Extinktionsmessung zur Desoxyribosebestimmung

Werte aus der photometrischen Messung, mit denen Die Eichgerade gebildet wurde Gefäß O 1 2 3 4 5 6 (Ref)

7

Desoxyribose [µg]

0

5

10

20

30

40

50

75

Desoyribose 1mg/ml [µl]

0

5

10

20

30

40

50

75

H2O auf 300 µl [µl]

300

295

290

280

270

260

250

225

DischeReagenz [µl]

700

700

700

700

700

700

700

700

Extinktion 598 nm

0

0,168

0,305

0,710

0,803

1,160

1,541

1,707

Tabelle 1: Extintionswerte für die Kallibrierkurve, abhängig von der Desoxyribosemenge.

Graph zu den Extinktionen in den beiden Küvetten aus den Werten nach der photometrischen Messung

Abb. 2: Kinetik: Extinktionskurve der enzymatischen und nicht-enzymatischen Reaktion, die obere Kurve ist die enzymatische, die untere Kurve die nicht-enzymatische Reaktion

IV.

Diskussion 1. Phosphornachweis durch Desoxyribosenachweis

Der Nachweis über Desoxyribose erfordert wenig technische Voraussetzungen und ist daher eine einfache Methode, um einen DNA-Nachweis durchzuführen. 2. Enzymatische und nicht-enzymatische Umsetzung des Schwefelderivates Glutathion Da die Reaktion der Umsetzung auch ohne Enzym stattfindet, ist die reine enzymatische Umsetzung etwas geringer, als die mittels Extinktion ermittelte. Die Extinktion des enzymatisch umgesetzten Glutathion dürfte lediglich bei 0,44 liegen, da 0,028 der Extinktion auf die nicht-enzymatische Umsetzung zurückzuführen sind. Dann wäre die Steigung der Extinktion nur durch die enzymatische Reaktion bei 0,146/min, und damit nur 15,96 mal schneller als die chemische Reaktion.

Protokoll zum Praktikum in Biochemie

III. Proteine vom 24.10.2012

I.

Einleitung

Proteine gehören neben Lipiden und Kohlenhydraten zu den drei wichtigen Makromolekülen, die am Zellaufbau und Erhalt der Lebensfunktionen beteiligt sind. Proteine sind dabei aus 20 verschiedenen Aminosäuren aufgebaut, die zu mannigfaltigen Strukturen und chemischen Eigenschaften führen. Daraus ergibt sich auch eine sehr variable Größe der Proteine, die mittels einer SAD-Page ermittelt werden kann. Ziel der Versuchsreihe ist, die Proteingröße und Konzentration von Cytochrom c zu ermitteln, welches als Probe, verunreinigt mit Bromphenolblau vorliegt. Cytochrom c ist ein recht kleines Protein mit einer Länge von 104 Aminosäuren, und einer Hämgruppe, die durch das enthaltene Fe3+ zu einer rötlichen Färbung führt. Es hat eine wichtige Funktion als Elektronencarrier in den Mitochondrien bei der oxidativen Phosphorylierung.

II.

Methoden

a) Aufreinigung der Cytochrom-c Probe mittels Gelfiltration Die Gelfiltration ist ein Trennverfahren, um Moleküle verschiedener Größe zu trennen. Dafür wurden Gelkügelchen mit einer fest definierten Porengröße (Sephadex G25) in eine Filtersäule auf eine dünne Watteschicht gegeben, und mit etwa 3ml Elutionspuffer (10mM MES ph 6,5, 100mM NaCl) gespült und feucht gehalten, bevor das eigentliche Trennverfahren durchgeführt wurde. Dann wurde die Probe auf die Gelmatrix aufgetragen und mit Elutionspuffer gespült. Die kleinen Moleküle des Bromphenolblau blieben in den Poren der Gelmatrix, während die größeren Moleküle des Cytochrom-c ungehindert passierten. In einem Eppendorfgefäß („G1“) wurde zunächst die farblose erste Phase aufgefangen, die vor allem Puffer enthält. Sobald die austretende Flüssigkeit eine rötliche Färbung annahm, wurde das Auffanggefäß gewechselt („G2“), um die Hauptphase, die den größten Teil Cytochrom-c enthält, aufzufangen. Die letzte, schwachrote Fraktion wurde in einem dritten Eppendorfgefäß („G3“) aufgefangen.

b) Bestimmung der Proteingröße mittels SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese SDS-PAGE ist ein Verfahren, um Proteine verschiedener Größen zu trennen, um anhand eines Markers die genaue Proteingröße zu ermitteln. Zunächst wurden zwei Glasplatten dicht miteinander verbunden, sodass sich zwischen den Platten durch die Spacer ein Spalt befindet. Dann wurde zuerst das Trenngel angerührt, indem die unten aufgeführten Lösungen zusammenpippetiert wurden, wobei APS und TEMED, die die radikalische Polymerisation des Acrylamid katalysieren, zuletzt zugegeben wurden. Nach dem Mischen wurde das Trenngel sofort zwischen die Glasplatten gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Nach dem Aushärten wurde das Isopropanol abgegossen, das Sammelgel angerührt und auf das Trenngel gegossen. Dann wurde der Kamm in das Sammelgel gesteckt, um die Taschen zu formen.

Die drei Proben (G1-G3) wurden für die Gelelektrophorese vorbereitet, indem je 20 µl mit 5µl von dem 5x Probenpuffer, der mit SDS und B-Mercaptoethanol versetzt war, für 5min. bei 95° inkubiert wurden, dadurch erfolgt die Denaturierung der Proteine, das Mercaptoethanol reduziert die Disulfidbindungen, das SDS bindet an hydrophobe Regionen der Proteine und gleicht durch seine starke elektronegative Ladung alle Ladungen der Proteine, zu diesem Zweck wurde SDS auch direkt in das Gel mit eingegossen.

Zu Vergleichszwecken wird ein komplexes Proteingemisch aus einer Thylakoidaufbereitung mit auf das Gel aufgetragen (5µl Thylakoidprobe, 15µl H2O, 5µl 5x Probenpuffer). Alle Proben wurden vollständig in die Taschen des Sammelgels pippetiert und parallel 4µl des Proteingelmarkers aufgetragen als Referenz für die Proteingröße. Die Elektrophorere lief bei 200V und 20mA für etwa 1 Stunde mit 1x Laufpuffer, der aus der 10x Stammlösung hergestellt wurde. In der Zeit wandern die Proteine durch die negative, angelegte Ladung, wobei kleine Moleküle schneller als große Moleküle sind, und so eine Auftrennung der Moleküle nach Größe erfolgt. Nach der Beendigung des Laufes wurden die Gele vorsichtig von den Glasplatten gelöst, mit H2O gewaschen und für 30 Minuten mit Coomassie, welches nur Proteine färbt, gefärbt. Die Färbelösung wurde mit Wasser abgespült, und nachdem das Gel über das Wochenende in einem Kühlschrank gelagert wurde, mit Entfärbelösung inkubiert, bis die Proteinbalken im Gel gut gegen das Gel erkennbar waren. c) Bestimmung des Proteingehalts in den Fraktionen der Gelfiltrationseluate 1. Bestimmung nach Bradford Der Bradford-Test ist eine Möglichkeit, Konzentrationen von Proteinen zu bestimmen. Dafür wird der Farbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 (CBBG) verwendet, der ungebunden rötlich ist, und sein Adsorptionsmaximum bei 470nm hat. Mit Proteinen bildet er allerdings blaue Komplexe, deren Adsorptionsmaximum bei 595 nm liegen. Dieser Umstand wird zur Grundlage gemacht, um die Konzentration eines Proteins anhand der Adsorption bei 595nm zu bestimmen. Vorraussetzung ist ein Abgleich mit der Extinktion einer bekannten Konzentration von Proteinen. 1.1 Erstellung einer Eichgeraden Die Eichgerade dient dem Abgleich der Extinktion der Probe mit der Extinktion bekannter Proteinkonzentrationen, um die Konzentration in der Probe bestimmen zu können. In diesem Fall wurde als Protein für die Eichkurve Rinderserumalbumin (BSA) in der Konzentration 0,1mg/ml verwendet. Es wurden in einer Doppelbestimmung zweimal je 7 Eppendorfgefäße des Volumens 1,5ml mit den in Tabelle X angegebenen Mengen BSA, Puffer und je 0,2ml Bradford-Reagenz befüllt und nach fünf Minuten wurde die Extinktionsmessung bei 595nm durchgeführt. Anhand der Mittelwerte der Messung wurde eine Eichgerade erstellt. 1.2 Bestimmung des Proteingehaltes der Fraktionen Eppendorfgefäße werden mit „B0“-“B3“ beschriftet, wobei B0 dem Nullabgleich dient und mit 5µl Elutionspuffer befüllt wird, B1-B3 werden mit je 5µl der entsprechenden Fraktionen G1-G3 befüllt,und alle Eppendorfgefäße mit Elutionspuffer auf 0,8ml aufgefüllt und 0,2ml Bradford-Reagenz zugegeben. Nach fünf Minuten wurde die Extinktionsmessung bei 595nm durchgeführt, und anhand der Eichgerade die Konzentration des Proteins bestimmt. Auch hier erfolgt eine Doppelbestimmung zur Erhöhung der Genauigkeit. 2. Bestimmung durch Fotometrische Detektion der Eigenabsorption bei 410nm Die Extinktion von Cytochrom-c hat bei 410 nm ihr Maximum, und als bekannte Festgröße gilt die Extinktion von 7,8 bei einer Konzentration von 1mg/ml. Anhand dessen ist es möglich, die Konzentration zu errechnen.

Dafür wurden die Fraktionen im Verhältnis 1:12 mit Elutionspuffer verdünnt, um die Extinktion unter einen Wert von 0,8 zu regeln, um eine genaue Messung zu gewährleisten. Dann wurden in die Küvetten 1ml der Lösung gegeben, und gegen den Elutionspuffer als Referenz bezüglich der Extinktion gemessen.

III.

Auswertung

a. BSA-Eichgerade

Abbildung 1: BSA – Eichgerade

b. Bestimmung des Proteingehalts in den Fraktionen der Gelfiltrationseluate nach Bradford Fraktion

GesamtExtinktionswerte volumen der Proben B1 bis B3 Fraktion [ml] a

b

der Mittelwert

ProteinGesamtAusbeute menge in Proteinmenge [%] Fraktion 5 µl [µg] in [mg]

B1

0,88 ml

0,012

0,001

0,007

~0

0

B2

0,48 ml

0,46

0,324

0,392

7

0,672

B3

1,02 ml

0,056

0,055

0,056

0,5

Gesamtprotein (Summe mg Protein aller Fraktionen)

0,1 ∑

0,772mg

∑

Tabelle 2: Die beim Bradford-Test erhaltenen Werte der einzelnen Proteinfraktionen sowie die abgeleiteten Proteinmengen der Eichgeraden, Messung bei 595 nm, B1-B3 aufgefüllt auf je 0,8 ml mit Elutionspuffer und 0,2 ml Bradfordreagenz

c. Bestimmung des Proteingehalts in den Fraktionen der Gelfiltrationseluate durch photometrische Detektion der Eigenabsorption bei 410 nm Fraktion

G1 G2 G3

Volumen

Farbe

Extinktionswerte

Verdünnung

0,88 ml farblos 0,003 1:12 0,48 ml rot 0,678 1:12 1,02 ml rötlich 0,072 1:12 Gesamtprotein (Summe mg Protein aller Fraktionen) Tabelle 3: Erhaltene Werte der Extinktionsmessung bei 410 nm abgeleitete Proteinmengen.

GesamtAusbeute proteinmenge [%] in Fraktion [mg] 0 0,54mg 0,12 mg ∑ 0,66mg ∑ der Proteinfraktionen und

d. Analyse der Gelfiltrationsfraktionen durch SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Abbildung 2: Gelelektrophorese bei 40 mA

! SDS-PAGE: ! Das Gel ließ sich problemlos von dem Glas lösen, und Anhand des Proteingelmarkers ist eine Größenbestimmung der Proteine gut möglich. Auf dem Gel ist eine sehr helle Bande bei der G2 Fraktion bei etwa 26kDa erkennbar, und bei allen drei Fraktionen ist eine breite Bande bei etwa 13kDa zu erkennen, wobei letztere Bande bei der G2 Fraktion besonders deutlich erkennbar ist. Die Bande bei 13kDa entspricht genau dem Proteingewicht von Cytochrom-c, und ist damit genau das richtige Ergebnis. Die Thylakoidaufbereitung, die zusätzlich aufgetragen wurde, bietet ein Bild vieler feiner Banden, wobei eine einzelne Bande bei 55kDa sehr deutlich erkennbar ist. Das ist damit zu erklären, dass in Thylakoiden viele verschiedene Proteine von verschiedener Größe vorhanden sind. Der breite Balken entspricht dem Protein RuBisCO, das in Thylakoiden in großem Maß vorhanden ist, da es für die Aufnahme von CO2 zuständig ist. ! ! ! !

Extinktionsmessungen: ! a) Nach Bradford: ! Für die Auswertung der Extinktionsmessung nach Bradford wurde die Proteinmenge in µg/5µl Fraktion anhand der Extinktion aus der Eichgerade abgelesen. Anhand dieses Wertes wurde die Proteinmenge in mg je Fraktion ausgerechnet, in Fraktion 1 befindet sich eine vernachlässigbar kleine Menge Protein, in Fraktion 2 0,672mg Cytochrom-c und in Fraktion 3 0,1mg, im Gesamten enthalten alle Fraktionen etwa 0,772 mg Cytochrom-c ! b) Eigenabsorption: ! Für die Auswertung der Extinktionsmessung durch Eigenabsorption wurde die Annahme zugrunde gelegt, dass eine Extinktion von 7,8 bei eine Konzentration von 1mg/ml zustande kommt. Daraus konnte anhand der Extinktion zunächst die Konzentration der Proben in den Küvetten errechnet werden, nachdem die Verdünnung raus gerechnet wurde, und die absolute Menge Protein durch raus rechnen des Volumens errechnet wurde, kam man auf den Wert, das Fraktion 1 vernachlässigbar wenig Protein, Fraktion 2 0,54mg Protein und Fraktion 3 0,12 mg Protein enthält. Im Gesamten enthalten alle Fraktionen etwa 0.66mg Cytochrom-c ! !

IV.

Diskussion

! SDS-PAGE ! Anhand der Banden in dem Gel lässt sich feststellen, dass Proteine von zwei verschiedenen Größen in der Probe vorhanden waren, eines war wie zu erwarten bei 13 kDa Cytochrom-c, da der zweite Balken bei ziemlich genau dem doppeltem Gewicht feststellbar ist, liegt der Verdacht nahe, dass es sich um eine Dimerisation des Cytochrom-c handelt, d.h. zwei Cytochrom-c-Monomere haben sich zu einem Dimer verbunden, der folglich auch das doppelte Molekülgewicht hat. ! ! Konzentrationsbestimmung durch Extinktion ! a) Nach Bradford: ! Durch die SDS-PAGE lies sich nachweisen, dass keine weiteren Proteine außer Cytochromc in den Proben enthalten sind. Durch die Extinktionsmessung nach Bradford kann nur die Konzentration von Proteinen, aber nicht spezifisch für ein Protein bestimmt werden, folglich ist die Reinheit der Probe in Bezug auf das Protein maßgeblich für eine exakte Bestimmung. Bei der Erarbeitung der Eichgeraden kam es leider in der ersten der Doppelbestimmungen zu nicht nachvollziehbaren Fehlern, die bedeutend zu hohe Extinktionswerte lieferten, sodass kein Mittelwert errechnet wurde, sondern direkt die Werte aus der zweiten Bestimmung zur Erarbeitung der Eichgeraden verwendet wurden. Als mögliche Fehlerquelle wird ein Pipettierfehler in Betracht gezogen, im Nachhinein ist das aber nicht weiter rekonstruierbar.

Eine Bestimmung der relativen Ausbeute, wie das Skript vorsieht, ist an sich nicht möglich, da die ursprüngliche Konzentration von Cytochrom-c in der Probe nicht bekannt ist. ! b) Durch Eigenabsorption: ! Die Bestimmung der Konzentration durch die Eigenabsorption lieferte Ergebnisse, die denen der Konzentrationsbestimmung nach Bradford sehr ähnlich sind, es kann also von einer prinzipiellen Richtigkeit der Ergebnisse ausgegangen werden. Auch hier ist die Bestimmung der relativen Ausbeute mangels Werten nicht möglich.

Protokoll zum Praktikum in Biochemie

V. Enzymkinetik mit dem Enzym Katalase vom 24.10.2012

Einleitung Im Stoffwechsel von Zellen spielen Enzyme eine wichtige Rolle. Viele Reaktionen können nur bei bestimmten Temperaturen oder bei einer entsprechenden Zufuhr an Energie ablaufen. Da die Energie im Körper begrenzt ist und auch die Temperatur bei 37°C - 42°C ihr Maximum erreicht hat, sind Biokatalysatoren, also Enzyme, unabdingbar, um Reaktionen zu beschleunigen, die unter normalen Bedingungen viel zu langsam ablaufen würden. Anhand der Katalase als Enzy...