II SDS, III IEF - Biochemie Praktikum SDS; IEF PDF

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Biochemie Praktikum SDS; IEF ...

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II. Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese SDS-PAGE Einleitung: Bei der SDS-Page werden entsprechend ihres Molekulargewichts denaturierte Proteine im elektrischen Feld aufgetrennt. Die Disulfidbrücken werden hierbei durch β-Mercaptoethanol reduziert und in Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen der Proteine aufgelöst. Durch das Binden der stark anionischen Detergenz SDS an das Protein wird eine konstante Ladung in die Polypeptidkette eingeführt, damit wird die Eigenladung der Aminosäureseitenketten überdeckt und der SDS-Protein Komplex erhält eine gelichmäßig negative Ladung. Als Puffersystem wird das diskontinuierliche Lämmli-System verwendet. Dabei überschichtet ein Sammelgel, in welches die Proben einlaufen, das Trenngel in dem die Proteine aufgetrennt werden. Die Gele unterscheiden sich in pH-Wert, Ionenstärke und Porengröße. Die großen Glycin-Ionen, die aus dem Ladepuffer in das Sammelgel eindringen, liegen bei dem neutralen pH-Wert des Sammelgels als Zwitterionen vor. Damit haben diese eine geringere Nettoladung und somit auch eine geringere Mobilität als die Chlorid-Ionen aus dem Gel (wandern Richtung Anode). Somit bilden die schnellen Chlorid-Ionen die Leit-Ionen und die sehr langsam wandernden Glycin-Ionen die Folge-Ionen, die SDSgebundenen Proteine wandern dabei zwischen den beiden „Ionen-Arten“. Anschließend werden die Proteine mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue eingefärbt. Dabei verschiebt sich das Absorptionsmaximum des Farbstoffs von 465nm bei Bindung an ein Protein auf 595nm, wodurch die Adsorption verstärkt wird. Die Proteine erscheinen nun als blaue Banden im SDS-PAGE-Gel.

Durchführung: Durchführung wie im Skript angegeben. Änderung: statt Carboanhydrase Alkoholdihydrogenase

Tabelle 1 Verwendetes Pipettierschema SDS-PAGE.

Reaktionsgef. 1. 2. 3. 4.

POD in µl 10 4 2 2

Ladepuffer in µl 4 4 4 4

DTT in µl 1,6 1,6 2,6 2,6

dd H2O in µl 0,4 6,4 8,4 8,4

Ergebnisse: 1

2

3

4 Referenz

Abbildung 1: Mit Coomassie Brilliant Blue angefärbtes Elektrophorese Gel. Proteine sind als blaue Banden sichtbar.

Abbildung 2: Zuordnung der Proteine den entsprechenden Banden der Referenz.

Auswertung:

II.1 Tabelle 2: Rf-Werte d. Größenmarker: Quotient aus Laufweite der Bande des betrachteten Proteins und der Laufweite der Proteinfront.

Protein Myosin Phosphorylase BSA Glutamic Dehydrogenase Alcohol Dehydrogenase Carbonic Anhydrase Lysozym Aprotinin Insulin, β Chain

Rf-Wert 0,08824 0,14706 0,20588 0,27941 0,36765 0,47059 0,67647 0,86765 1

Molmasse in kDa 198 98 62 49 38 28 14 6 3

Abbildung 3: Halblogarithmische Auftragung d. Molmassen.

Tabelle 3: aus dem Graphen bestimmte Proteinmassen.

Protein Meerrettich-Peroxidase (1) Meerrettich-Peroxidase (2) Conalbumin (3) Alkoholdihydrogenase (4)

Rf-Wert 1,6 1,6 1,4 2,2

bestimmte Molmasse 56,1 56,1 62 43,9

Fragen: II.2 Wird die Probe mit zu wenig Ladepuffer versetzt, dann können nicht genug bis keine Glycin-Ionen aus dem Laufpuffer in das Sammelgel eindringen, somit fehlen die Folge-Ionen und es kommt zu keinem Spannungsgradienten und damit auch nicht zur Bewegung der Proteine im Gel. II.3 Die Acrylamidkonzentration und die Länge der Trenngels bestimmen das Auflösungsvermögen der SDS-Page. II.4 Das Dithiothreitol reduziert die vorhandenen Disulfidbrücken, damit wird die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine aufgelöst. Anschließend wird die Probe erhitzt damit sich das Natriumdodecylsulfat an das Protein binden kann. II.5 Nach erfolgter SDS-PAGE-Analyse wird keine enzymatische Aktivität der Alkoholdihydrogenase erwartet, da um die Proteine auftrennen zu können, denaturierende Bedingungen angewandt werden. (DTT; Erhitzen…)

III. Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Einleitung: IEF ist die Trennung der Proteine nach dem pH-Wert, da jedes Protein einen eigenen Isoelektrischen Punkt besitzt (Protein erscheint neutral und wandert nicht mehr im elektrischen Feld). Für die IEF muss ein Proteingel mit einem pH-Gradienten hergestellt werden. Dazu werden lösliche zwitterionische niedermolekulare Verbindungen (Ampholyte) ins Gel hinzugegeben. Wird diesem Elektrolytsystem nun ein Protein zugesetzt, wandert dieses zu seinem IEP.

Durchführung: Durchführung wie im Skript angegeben.

Ergebnis:

Abbildung 4: Ergebnis der IEF, 3 Banden sind sichtbar

Auswertung: III.1 Banden: 3 Da eine IEF durchgeführt wurde, wurde nicht nur eine Bande erwartet, da es sich aber um „isomere“ Enzyme handelt wird wiederrum im Endeffekt nur eine Bande erwartet. Die restlichen Banden sind Verunreinigungen vom Hersteller. III.2 Isoenzyme katalysieren die gleiche chemische Reaktion, unterscheiden sich jedoch unterscheiden sich in ihrem Aufbau, bei Proteinen in der Aminosäurensequenz. Fragen: III.3 Die Anordnung der POD-Isoenzyme nach ihrer Molekülmasse ist nicht möglich, da sie Größe der Proteine bei der IEF keine Rolle spielt. III.4 Als Isoenzyme, sind verschiedene Formen von Enzymen, wenn diese die gleiche chemische Reaktion katalysieren . Die einzelnen Formen gleichen sich in der Spezifität für das umgesetzte Substrat, sind jedoch in ihrem Aufbau verschieden, bei Proteinen in der Aminosäurensequenz.

III.5 Nativ-Gelelektrophorese zur Untersuchung der Proteinfaltung Die Probenvorbereitung findet im Gegensatz zur SDS-PAGE ohne Aufkochen der Proteine statt. Gelegentlich werden auch die Disulfidbrücken durch Weglassen von Reduktionsmitteln erhalten. In der Gelelektrophorese erfolgt die Auftrennung im Gegensatz zur SDS-PAGE nur nach dem isoelektrischen Punkt (bzw. der Nettoladungsdichte) und dem hydrodynamischen Volumen, nicht nach der Molekularmasse. 

SDD-AGE zur Untersuchung von Proteinaggregaten SDS-resistente Proteinkomplexe sind Verbände aus mehreren Proteinen, die bei Raumtemperatur bei einer SDS-Konzentration von 2 % (m/V) nicht denaturieren. Ihre Molmassen betragen oft zwischen 200 kDa und 4000 kDa, deswegen wird ein Agarosegel mit großen Porendurchmessern verwendet. Nach der Elektrophorese erfolgt, analog zum Western Blot bei einem Polyacrylamidgel, ein Proteintransfer auf eine PVDF-Membran und eine Immunfärbung der Proteine auf der Membran. Somit können Konformationsvarianten der Proteine eines Proteinaggregats unterschieden werden. 

III.6 2D-Gelektrophorese Die 2D-Gelektrophorese findet in zwei Schritten statt: Im ersten Schritt, der ersten Dimension (IEF), werden die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt getrennt und im zweiten Schritt ,2. Dimension(SDS-PAGE) werden sie dann nach ihrem Molekulargewicht getrennt. Dazu wird das elektrische Feld senkrecht zur Laufrichtung der 1. Dimension angelegt. Anschließend werden die Proteine durch Färbung sichtbargemacht....