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Cours de biologie moléculaire....

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Biologie moléculaire

Biologie moléculaire = étude des macromolécules, principalement ADN/ARN/protéines (on étudiera la structure et la synthèse pour ADN et ARN et seulement la synthèse pour les protéines).

I-

Caractérisation et détection de l’ADN 1) Structure de l’ADN

a. Rappels L’ADN se présente sous la forme d’une double hélice comportant 2 chaines. Une chaine est une macromolécule = polymère d’un élément qui se trouve répété le long de la chaine. Cet élément constitutif est le nucléotide. Il est constitué de 3 éléments différents : base azotée liée à sucre lui-même lié à un phosphate (figure 1). Le phosphate est un dérivé de l’acide phosphorique (3 fonctions acides). Le sucre : désoxyribose, pentose avec un H en C2 au lieu d’une fonction alcool (cas du ribose). Le sucre est un aldéhyde ou une cétone comportant au moins 2 fonctions alcool sur les autres carbones. Cyclisation du sucre. Les bases azotées : 2 types : bases puriques (2 cycles : Adénine Guanine) et base pyrimidiques (1 cycle : Cytosine Thymine, Uracile pour ARN)

La liaison base-sucre se fait par l’intermédiaire de l’azote au C1 du sucre. Sucre + base = nucléoside. La liaison entre le sucre et le phosphate implique une fonction acide du phosphate et un OH en C3 ou C5 d’un sucre. Liaison ester.  Liaison phosphodiester (un phosphate est lié à 2 sucres) dans l’ADN.

Structure primaire : 5’P ACTGCCATCG 3’OH pApCpTpGpCpCpApTpCpG (pas de p car OH) Structure secondaire : Deux chaines reliées entre elles par des liaisons hydrogènes entre les bases. A avec T et C avec G car les liaisons H ne peuvent pas se faire sinon. (les ARN en ont : ARNt et ARnr) Pour séparer les brins : dénaturation. Pour cela on apporte de l’énergie (chaleur), des agents comme la soude peuvent le faire aussi. Pour suivre l’évolution de la dénaturation : suivre l’absorbance en même temps qu’on chauffe la solution d’ADN grâce aux doubles liaisons des bases. ADN double brin ou ADN simple brin absorbe à la même longueur d’onde (260nm). Ce qui va est diffèrent c’est le coefficient d’extinction. Un ADN simple brin absorbe plus que l’ADNdb (pour le même nombre de bases). Dans la double hélice : les bases sont à l’intérieur donc moins touchées par les rayons UV. Courbe de dénaturation : Tm = température pour laquelle la moitié de l’ADN est dénaturé. Tm est propre à un ADN donné dans un milieu donné. Tm va varier suivant le pourcentage de CG, la taille de la molécule (que pour les oligonucléotides (long jusqu’à 50/100 nucléotides) car à partir d’une longueur cela ne fait plus beaucoup varier la Tm) ou encore la présence de facteurs facilitant les liaisons H (sels) ou défavorisant. Equation pour calculer le Tm : 81.5°C + 16.6log[NA+] + 0.41x(%GC) – 600/l avec l la longueur de l’oligonucléotide comprise entre 14 et 70 nucléotides. Si plus grand on ne le prend pas en compte. (Tm = 2AT + 4 GC).

 Dénaturation = séparation des 2 brins d’ADN = rupture des liaisons hydrogènes Agents dénaturants : pour ADN : chaleur, NaOH, urée - pour ARN : formaldéhyde, formamide (la soude hydrolyse l’ARN le OH- de la soude réagit avec le OH en 2’ du ribose  rupture de la liaison ester) Renaturation : réassociation des 2 brins de la molécule d’ADN initiale = favoriser l’établissement de liaisons H, présence de NaCl Hybridation : association d’un brin d’une molécule d’ADN avec un brin d’une autre molécule (ADN ou ARN) Tm : température de fusion : température pour laquelle la moitié de l’ADN est sous forme simple-brin. Exercice : Le DNA du bactériophage M13 a la composition en bases suivante : A : 23% T : 36% G : 21% C : 20%

A quelle modification de l’absorbance à 260nm peut-on s’attendre quand on chauffe cet ADN à 90°C ? Il n’y a pas d’égalité entre les % donc c’est un ADN simple brin, il va absorber de la même manière. Structure tertiaire : Déterminée par cristallisation puis diffraction par rayons X. Hélice, base forment des « plateaux » perpendiculaires à l’axe de l’hélice. 10pdb par pas (3.4 nm) (ARN ont des structures tertiaires)

b. Topologie de l’ADN : La double hélice s’enroule autour de protéines, les histones  degré de compaction mais non suffisante pour former les chromosomes. Les nucléosomes vont être repacter, reboucler. Cet ADN peut exister sous deux formes selon le degré de compaction, ceci résulte de modifications épigénétiques des histones : les histones sont acétylés dans l’euchromatine (ADN accessible) et non acétylés dans l’hétérochromatine avec compaction plus forte des nucléosomes. Mais aussi à cause de la méthylation sur l’ADN : les cytosines des îlots CpG (séquence d’ADN riche en paire CG) de l’hétérochromatine sont méthylées.

Dans les cellules procaryotes, le chromosome bactérien a une association ADN-protéine. Le plasmide, ADN double brin circulaire, peut se trouver sous différentes formes : circulaire relâché ou encore compacté (torsions).

A, B et D : même pdb, le nombre de tour d’hélices T est différent C et E : présence de supertours (W) B → C : C a 2 tours de plus (augmentation de la contrainte  compensé par 2 supertours dans le sens inverse) sens négatif si dans

le sens contraire de la double hélice, positif si même sens D → E : perte de 2 tours d’hélice  compensation par 2 supertours dans le sens inverse C → F : suppression de tours d’hélice localement (situation rencontrée en réplication et transcription). Quand supertours négatifs et qu’on perd des tours, T diminue donc W doit augmenter (ici |w| diminue).  Un super enroulement négatif favorise l’ouverture local de la double hélice. Les plasmides sont la plupart du temps superenroulés négativement, le seul cas où il est positif sera dans certains organismes où il faut s’opposer à l’ouverture de la double hélice (cas des archées qui se développent en milieu chaud et qui favorise donc la dénaturation).

Comment visualiser ses formes, comment savoir qu’il y a plusieurs formes ? Grâce à l’électrophorèse. L’ADN va migrer car il est chargé négativement vers le pôle + dans un gel d’agarose dont les mailles vont être plus ou moins grande  séparation de l’ADN suivant la taille et la forme de l’ADN. La forme relâchée (prend plus de place) migrera moins loin qu’une forme plus condensée. Pour détecter l’ADN : ajout d’un intercalant fluorescent, le BEt (se glisse entre les plateaux de pdb) = Bromure d’Ethidium.

Quand on ajoute le BEt de façon saturante (W 0. Si l’ADN plasmidique est sous forme relâchée, il y a souvent présence d’une hémi-coupure (si forme hémicoupée → forcément relâchée).

Quand on extrait du plasmide, on s’attend à avoir une forme majoritaire, la forme superenroulée, qui va migrer plus vite que l’autre, la forme relâchée (souvent hémi-coupée). Pour contrôler lors d’une étude topologique, on met un plasmide dont on sait qu’il sera hémi-coupé et donc relâché sous l’action de la DNase I (fait des hémi-coupures sur l’ADN). On l’utilise de façon ménagée = avec un temps court et une activité faible, car on espère une seule hémicoupure par molécule d’ADN → conversion de tout l’ADN en hémi-coupé (plus de supertours). Comment se créent in vivo les supertours ? Les topoisomérases en sont responsables. Elles créent des molécules qui vont être superenroulées de façon différentes. Quand des molécules diffèrent seulement du degré de compaction, elles sont appelées des topoisomères.

exp1 : sans BEt ; exp2 : avec BEt

2) Enzymes de restriction et cartes physiques Dans une bactérie, l’enzyme de restriction aide à lutter contre l’invasion d’ADN étranger. La bactérie a développé un système pour stopper cet envahisseur : enzyme de restriction qui va pouvoir cliver l’ADN du bactériophage. Or rien ne différencie l’ADN de la bactérie de celui du bactériophage → L’ADN de la bactérie va se modifier pour ne plus être susceptible d’être coupée par méthylation à certains sites, ainsi les endonucléases couperont seulement l’ADN étranger. Pour les enzymes de type I et III : le même complexe comporte l’activité de méthylation et l’activité de l’endonucléase. Ex : Type I a 2 sous-unités de Restriction, 2 Méthylase et 1 Site de reconnaissance On ne parlera que du type II.

Type II : Comporte que l’activité endonucléase (il faut une méthylase en plus), le site reconnaissance forme un palindrome, la coupure se fait au niveau du site reconnu.

L’enzyme de restriction ne fonctionne que sur du double brin. Particularité des sites : symétrie.

Isoschizomères = enzymes de restriction qui reconnaissent la même séquence (mais coupure pas forcément au même endroit) mais d’origine différente et peuvent avoir des sensibilités à la méthylation différente. Ex : Asp 718 : 5’ g gatcc 3’ Kpn I : 5’ ggatc c 3’ Bam HI : 5’ g gatcc 3’ Utilisation première des enzymes de restriction : faire des cartes de restriction Les fragments de restriction sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gel d’agarose. Leur visualisation s’effectue grâce au BEt. Leur taille peut être évaluée grâce à des marqueurs de taille moléculaire. Lorsque l’ADN hydrolysé est de petite taille (plasmide, quelques kpdb) le nombre de fragments de restriction est faible et ceux-ci sont en général bien séparés sur le gel. Mais lorsque l’ADN hydrolysé est de grande taille, les fragments ne sont plus séparés : ils apparaissent comme un « nuage fluorescent » ou « smear ». Pour détecter un fragment particulier, il est nécessaire d’avoir recours au Southern Blot. La relation entre la taille et la distance de migration : courbe étalon (voir poly)

Exercice 4 : fréquences théoriques de coupure par les endonucléases de restriction Pour le premier nucléotide : ¼ chance pour que ce soit le premier nucléotide correspondant au site de restriction, pareil pour le second etc : ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = 1/256 → si la répartition des bases est parfaite, l’enzyme doit trouver son site tous les 256 pdb. Ce n’est jamais le cas mais ceci nous donne un ordre de grandeur. 1

Pour site à 6 pdb : ¼ 6 = 4096 fréquence de coupure  Nombre de fragments : - pour 4 pdb : 18750  smear - pour 6pdb : 1171  smear Comment détecter sur un de ces fragments, une séquence particulière ? Grâce à une sonde marquée qui porte un ADN complémentaire au fragment. Une fois migration : dénaturation pour avoir du simple brin.

Southern Blot

3) Southern Blot Comment transformer l’ADN en sonde marquée ? Par radioactivité. Comment l’incorporer ? On fait une copie de l’ADN par des DNA polymérases qui ajoutent des dXTP à l’amorce (en enlevant 2 phosphates) par liaison phosphodiester (5’ → 3’). C’est le Pα qui sera donc marqué. On se sert de la DNA pol I. Toutes les polymérases ont une activité exonucléase 3’→ 5’.

Taq pol : ADN polymérase thermostable. Reverse transcriptase : synthétise ADN complémentaire à partir d’ARN. Klenow : sous-unité de la DNA pol I de coli ne portant pas l’activité exonucléase 5’→3’ (n’existe pas in vivo), ADN pol I : quand hémicoupure, elle synthétise de 5’ vers 3 ‘ et lorsqu’elle tombe sur l’extrémité 5’ elle clive les nucléotides un par un et continue à polymériser.

a. Marquage interne Marquage par « random priming » : Amorcer au hasard la synthèse d’ADN à partir d’une matrice d’ADN que l’on veut copier. Protocole : Pour avoir des amorces utilisables pour n’importe quel marquage (donc non spécifiques) on fait un mélange d’oligonucléotides (9-12 nucléotides de long) utilisant les 4 bases pour avoir toutes les combinaisons possibles des 4 bases sur la longueur de l’oligonucléotide → Il y aura donc une combinaison de ces bases qui sera complémentaire du brin. Après dénaturation de l’ADN, à marquer, certains de ces nucléotides sont capables de s’hybrider sur les brins matrices de façon aléatoire sur toute la séquence de ces brins. On fait ensuite agir le fragment de klenow pour allonger ces oligonucléotides et synthétiser un brin radiomarqué grâce au 32Pα. La taille des brins est inférieure à celle de la matrice mais dans l’ensemble elles correspondent à la séquence du brin matrice (si on en met bout à bout). Chaque brin matrice n’est utilisé qu’une fois, si on a n brins au début on aura n brins marqués à la fin. Pour avoir une sonde longue de 150-200 pb il faut un brin matrice d’au moins 300 pb, on ne marquera donc pas des fragments d’ADN inférieur à 300 pb car on les considère comme des sondes courtes, on utilisera d’autres techniques plus efficaces.

La découverte d’ADN pol thermostable a permis d’enchainer des cycles de dénaturation car elles y résistent. PCR : appareil capable de faire varier la température à des valeurs précises dans un laps de temps très court. 1 cycle de PCR : - Dénaturation à 92°C - Hybridation des amorces : une qui se fixe en 3’ du brin inférieur et une autre qui se fixe en 3’ du brin supérieur → séquences différentes, amorces spécifiques de chacun des 2 brins donc on connait déjà la séquence que l’on veut amplifier. Température dépend du Tm des amorces. - Polymérisation à 72°C par la Taq pol

Devenir de chaque brin : Le produit borné par les 2 amorces va être produit de façon exponentielle. Première apparition des deux brins bornés : 3ème cycle. Au bout de n cycles, 2n copies mais ceci est théorique (rendement de 100% impossible). Mélange réactionnel de PCR : Amorces, TaqPol + Mg, dXTP, ADN matrice, tampon. Amorces et dXTP en excès car il en faut suffisamment pour le nombre de cycles voulu et le rendement. En général, on ne fait pas de marquage radioactif en PCR mais des marquages froids. Pour détecter la sonde, on utilise un anticorps contre quelque chose que l’on va introduire dans les brins synthétisés brin : la digoxygénine (produite par les plantes). La base est séparée de la DIG par une longue chaîne carbonée pour conserver la structure hélicoïdale et repousser la DIG à l’extérieur de l’hélice afin qu’il soit accessible pour l’anticorps. L’anticorps est lié à une activité enzymatique, on apporte le substrat de l’enzyme → révélation de la sonde hybridée à l’ADN. b. Marquage des extrémités des fragments Quand on a des oligonucléotides à marquer : on marque une extrémité (5’ ou 3’). Dans tous les cas on peut utiliser les extrémités 5’ pour les marquages. En 5’ il faut enlever le phosphate (qui devient OH) grâce à une phosphatase alcaline puis rajouter un phosphate radiomarqué, le Pγ de l’ATP, grâce à une polynucléotide kinase. Les produits PCR ne sont pas phosphorylés (car les amorces ne le sont pas car libérées de leur synthèse par clivage du 5’OH), quand on a besoin qu’ils le soient on utilise cette technique. Dans certains cas, on peut utiliser l’extrémité 3’ seulement si elle est « rentrante » (pour que le brin complémentaire soit matrice).

c. Transfert Sur la membrane, on met en contact la sonde après l’avoir préalablement dénaturée et réalisé une étape de préhybridation : utilisation d’un tampon contenant des composés capables de se fixer sur les sites de fixation de la membrane pour qu’il n’y ait aucun moyen de fixation de la sonde de manière non spécifique. Pour l’hybridation, la sonde est dans un tampon d’hybridation contenant, pour favoriser les liaisons hydrogènes entre la sonde et l’ADN, des sels. Ensuite on réalise un premier lavage pour éliminer l’excès de sonde. Mais la sonde peut s’hybrider sur quelques bases,

donc on augmente la température et on diminue la concentration en sels pour déstabiliser ce type d’hybrides. Stringence = force de déstabilisation (forte stringence = forte température et faible concentration en sels) Lorsqu’on obtient une seule bande, on peut être sure qu’il n’y a qu’une copie de gêne si le fragment contient peu de pb. Si on voit deux bandes (après restriction par une autre enzyme pour voir le nombre de copies) il peut très bien y avoir un seul gène qui a été coupé en 2 par l’enzyme (dans ce cas-là l’intensité est identique dans les deux bandes et dans la bande unique initiale, lorsque qu’il y a 2 gènes l’intensité sera plus faibles dans les 2 bandes).

Comment séparer les fragments pour avoir seulement le fragment d’intérêt ? On va utiliser des bactéries pour trier grâce aux vecteurs et notamment les vecteurs plasmidiques. Chaque bactérie ne va pouvoir intégrer qu’un plasmide du même type. Plasmide = ADN circulaire double brin qui peut se répliquer indépendamment de génome. Ori définit le nombre de copie de plasmide dans la bactérie → L’origine de réplication régule le nombre de copies. Lorsqu’un plasmide va rentrer dans une bactérie (transformation), il sera copié en nombre définit par Ori, si un plasmide ayant la même origine de réplication rentre, il ne sera pas copier car la limite est atteinte. C’est cette propriété qu’on applique dans le clonage, il n’y aura qu’un plasmide par bactérie (une origine de réplication unique) qui sera ensuite copié. Principe : on va inclure ces fragments d’ADN d’intérêt dans le plasmide, qui sera dit recombinant, puis on transforme les bactéries avec ce mélange de vecteurs qui ont tous la même origine de réplication mais un fragment différent (ou non) et enfin on sélectionne les bactéries....