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Cours en distentiel avec Marie-Line Daveran-Mingot...

Description

Biotechnologies des micro-organismes Biotechnologies = la technologie du vivant (-bios) -

Biotechnologies vertes : le végétal (agriculture, alimentation, OGM) -> agrifood biotech Biotechnologies rouges : application médicales (protéines thérapeutiques, diagnostic, thérapie génique) -> healthcare biotech Biotechnologies bleues : la vie marine Biotechnologies blanches : biotechnologie industrielle -> industrial biotech Biotechnologies jaunes : l’environnement

Il y a trois domaines du vivant : -

Eucaryotes Bactéries Archées

Les bactéries et les archées forment les procaryotes Les eucaryotes possèdent un noyau, chloroplastes, mitochondries, RE, appareil de golgi contrairement aux procaryotes En générale les procaryotes sont de l’ordre du μm (10-6m) Les procaryotes sont partout : -

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Air Sol, sous-sol, sédiments Minéraux Régions volcaniques Antarctique Eau o Eaux sulfureuses chaudes o Cheminées hydrothermales abysses, fumeurs Mais aussi chez nous, dans le microbiote intestinal

Une grande diversité métabolique et de nombreuses spécificités

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Biotechnologies des micro-organismes Comment utiliser les micro-organismes ? -

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Sélectionner les micro-organismes dans la nature o Grande diversité inter-espèces mais aussi intra-espèces  On a le cœur génome : gènes communs à toutes les souches  Génome accessoire : gènes non communs à toutes les souches  Au sein d’une espèce, certaines peuvent donc faire des trucs et d’autres non Améliorer et faire évoluer les micro-organismes pour l’adapter à certaines conditions o Jouer sur la physiologie de la souche o Evolution expérimentale -> pas d’OGM Modifier génétiquement les micro-organismes pour les rendre plus performant -> OGM o Ingénierie métabolique o Biologie synthétique

Domaine dans les biotechnologies : -

Agriculture Alimentation Enzymologie Environnement/bioremédiation Nanotechnologie Production d’énergie Santé/médecine

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Agriculture : Utilisation de pesticides parce qu’il y a des attaques des parasites sur les récoltes (930 tonnes d’insecticides/an en 2014) La plupart des pesticides sont organo-phosphates (60%) dangereux pour l’Homme La pyrale du mais d’abord une chenille qui attaque le maïs mais pas que, dangereux pour l’homme, besoin d’utiliser des biopesticides 1. Les biopesticides Exemple : bacillus thuringiensis (Bt) a des vertu insecticide = la sporéine Il va faire une endotoxine, il la produit que dans les spores On bascule dans la sporulation quand il y a un stress Quand on est en croissance, on a nos polymérases qui ont un facteur σ, quand on passe en sporulation, on change de facteur σ (σH) Pendant la sporulation, la cellule ne se divise plus, elle est très résistante

Les endotoxines peuvent être différentes, il va y avoir une spécification de l’endotoxine sur les chenilles De base cette endotoxine n’est pas active ; protoxine, elle va être cliver et libérer le monomère actif La toxine doit être ingéré dans les cibles (sous forme protoxine) quand elle est digérée par des protéases, cela libère la toxine Deux types de toxines : -

Cry Cyt

La toxine libérée se fixe sur les cellules intestinales et fait un trou, l’insecte meurt parce qu’il ne pourra plus s’alimenter Une même souche peut produire plusieurs toxines apparentées et dirigées contre un autre d’insecte donné

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Biotechnologies des micro-organismes On a deux fragments : -

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Fragment structural : o Stabilité du crystal par ponts disulfures o Rôle dans le maintien et la solubilité o Pas de rôle majeur dans la toxicité Fragment toxique : responsable de ‘activité insecticide o Domaine I : Interaction avec récepteur (?) et clivage après interaction o Domaine II : Reconnaissance et fixation sur le récepteur o Domaine III : Formation du pore et spécificité vis-à-vis de l’insecte

Récepteurs de « Cry1A » -

CADR = Cadherine like APN = aminopeptidase ALP = alkaline phosphatase GCR = glycoconjugé de 270kDa

Mode d’actions : plusieurs hypothèses mais pour les deux formations du pore -

Clivage du monomère, il peut s’oligomérisé quand fixé à la cadhérine qui permet de former le pore -> modèle de formation du pore Fixation à la cadhérine et transduction du signal par la voie d’adénylcyclase et formation du pore -> modèle de transduction du signal

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Biotechnologies des micro-organismes Zoom sur la formation du pore : modèle 1

Le monomère a une faible affinité avec les récepteurs mais dès qu’il est en oligomères suite au clivage à la cadhérine on obtient une forte affinité Modes d’utilisation : -

Poudre mouillable, pulvérisation Plantes transgéniques (plantes qui ont la toxine) o Interdit depuis 2014

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Alimentation : Les fermentations (production en bioréacteurs) produisent : -

Acides aminés, d’arômes et de vitamines (ex : arôme acétoine avec un goût de beurre) Aliments fermentés Biopréservation (conservateurs : E….. et ex : E234 = Nisine)

Quelques généralités sur les fermentations : Lorsqu’il n’y a pas de respiration aérobie ou anaérobie, le NADH formé au cours de la glycolyse et lors de l’oxydation du GA3P doit être réoxydé en NAD+, sinon la glycolyse s’interrompt. Définition : Processus métabolique qui libère de l’énergie contenue dans un sucre ou autre molécule organique qui ne nécessite pas d’O2 ni de chaîne de transport d’électrons et qui utilise une molécule organique comme accepteur d’électron final. A choisir les microorganismes préfèrent utiliser l’oxygène mais quand pas le choix utilise la fermentation On démarre avec des produits peu chers pour avec des choses plus chers, le but aussi est d’utiliser les déchets grâce à la fermentation Productions d’acides aminés : Parmi les 20 AA composants les protéines, on en a 9 qui ne sont pas synthétisés par l’Homme et les animaux (Valine, Leucine, Isoleucine, Lysine, Thréonine, Méthionine, Histidine, Tryptophane, Phénylalanine) 4 méthodes de production : -

Extraction à partir d’hydrolysats de protéine Synthèse chimique Transformation à partir de précurseurs chimiques (réactions cellulaires ou enzymatique) Fermentation par micro-organismes (souches optimisées)

E621 : acide glutamique Corynebacterium glutamicum : bactérie qui en produise en quantité non négligeable Mais y’a un « verrou » qui fait que les sauvages en produisent en faibles rendement

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Ce qu’on ajoute ou enlève (biotine, tween) c’est pour limiter la biosynthèse des lipides Avec la pénicilline en faible quantité, on en fait des peptidoglycanes plus lâches pour avoir une paroi plus lâche, afin de faire sortir le produit !

En changeant les conditions, on a eu le transporteur qui a changé de conformation et est devenu « plus performant » pour excréter le glutamate

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Aliments fermentés : L’intérêt ? -

Conservation des aliments o Abaissement du pH après formation acide organique (choucroute) Amélioration de la digestibilité o Hydrolyse enzymatique (saucisse) Révélateur de goût o Graine de soja + blé + inoculation avec Aspergillus o Reprise de l’eau salée + lactobacilles + levures  Hydrolyse protéines soja -> aa  Amidon transformé en sucres simples -> fermentation alcoolique et lactique

Autres aliments fermentés : légumes et jus-fermentés ; le levain ; l’ensilage (maïs, pulpe de betteraves)

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Starter culture : permet de commencer direct la fermentation

Le Yaourt : -

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Le goût La digestibilité o Dégradation lactose (source de sucre) o Viscosité Apport nutritionnel o 90kcal/125g o Protéines (caséine) o Calcium o Phosphore o Riboflavine (vitamine B2) Très très consommé

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protocoopération : encore plus performant à deux ! 1+1 =3 La première commence et produit des substrats que la seconde à besoin, et la première s’arrête parce qu’elle est sensible à l’acide qu’elle produit Ça coagule parce qu’on a acidifié

La biopréservation : Production de bactériocines (peptidides) Les bactériocines se définissent comme des protéines ou complexes de protéines avec une activité bactéricide contre des espèces proches de la souches productrices. Les bactériocines de bactéries lactiques ont une activité contre les bactéries Gram+ (anti-listeria par ex)

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la nisine s’enfonce, plusieurs, au niveau du lipide II

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SANTE/MEDECINE : Probiotiques -

Les probiotiques : microorganismes vivants qui lorsqu’ils sont administrés en quantité suffisante peuvent exercer un effet bénéfique pour la santé de l’hôte Les prébiotiques : Substances non assimilable (sucre des fois) par l’hôte stimulant le développement des probiotiques (l’inuline, oligofructose…)

Tractus gastro-intestinal : estomac, intestin grêle, gros intestin (colon) -> il y a la flore commensale = Microbiote ! Notre ventre est notre deuxième cerveau (+ 200 millions de neurones) Métagénome intestinale (bactéries de l’intestin humain) = 15 000 à 36 000 espèces bactériennes dans l’intestin humain -> le microbiote est unique à tout un chacun o

Principaux = Firmicutes (low GC Gram+) et Bacteroidetes

Facteurs modulant l’installation du microbiote intestinal : -

Facteurs génétiques (peu influents) Facteurs environnementaux o Mode de naissance o Régime alimentaire o Traitements antibiotiques

Le microbiote ne bouge pas après deux ans ! Il rebougera pendant la vieillesse Le microbiote permet la mise en place du système immunitaire aussi -> si y’a un bug -> allergies ! Notre intestin est bien peuplé, mais la densité de population n’est pas la même partout :

Les probiotiques vont prendre la « place » des pathogènes, vont être en compétitions Les micro-organismes ont des MAMPs (lipoprotéines, sur l’adn….) ou PAMPs (dans le cas des pathogènes) reconnus par des TLR -> réponse anti-inflammatoire ou pro-inflammatoire

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Biotechnologies des micro-organismes Notre cerveau communique avec notre microbiote et notre microbiote communique avec notre cerveau :

Le GABA produit par certaines bactéries et qui jouent le rôle d’antidépresseur Principaux tests utilisés pour sélectionner une souche probiotique. Y’a-t-il des gènes « marqueurs » putatifs associés Caractéristiques : -

Résistance à l’acidité gastrique Résistance eaux sels biliaires Adhérence au mucus et/ou aux cellules épithéliales et lignées cellulaires (pas besoin d’être totalement adhérente pour bien fonctionner !) Activité antimicrobienne Habilité à réduire l’adhésion des pathogènes

Gènes marqueurs possibles ? -

bsh : gène codant hydrolase de sels biliaires mub : gène codant une protéine d’adhésion au mucus fbpA : gène codant une protéine de liaison à la fibronectine slpA : gène codant une protéine de la couche S impliquée dans m’adhésion aux cellules de l’intestin

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Production d’antibiotiques -

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200 antibiotiques fabriqués industriellement Un grand marché mondial de plusieurs milliards de dollar Volume : 50 000 tonnes Plusieurs classes : o Antibactériens o Antifongiques o Antiprotozoaires o Antiviraux Plusieurs types d’antibiotiques o A large spectre : actif sur Gram+ et Gram- (Tétracyclines) o A spectre étroit : actifs sur Gram+ ou Gram- (Gentamycine) o Sélectifs : actifs sur pathogènes précis (isoniazide) Deux types d’effet : o Bactéricide : tue l’organisme cible (dose dépendant) o Bactériostatique : inhibe la croissance de manière réversible

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Les Streptomyces (actinomycètes) jouent un rôle central dans la production d’antibiotiques Les meilleurs producteurs seront les Gram + Les antibiotiques sont des métabolites secondaires :

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Une bactérie qui produit un antibiotique a automatiquement un gène de résistance ; on ne peut pas améliorer la production si la résistance ne suit pas. Pour améliorer la production : -

Une mutagénèse aléatoire Du génie métabolique en ciblant les gènes que l’on veut modifier (surproduire)

Quelles cibles ? -

Accroître la synthèse des précurseurs issus du métabolisme primaire Accroître l’efficacité du système de résistance à l’antibiotique produit Accroître l’activité d’une, voire de la totalité des enzymes intervenant dans la voie de biosynthèse de l’antibiotique Augmenter la vitesse d’expression de l’antibiotique Eliminer les étapes enzymatiques entraînant une dégradation de l’antibiotique

DU GENIE GENETIQUE A L’INGENIERIE METABOLIQUE EN PASSANT PAR LA BIOLOGIE SYNTHETIQUE : L’ingénierie métabolique c’est reprogrammer une cellule avec des voies de biosynthèse qui n’existent pas telles quelles dans la nature = véritable lego biologique = ingénierie métabolique Il existe plusieurs niveaux de programmation en ingénierie métabolique

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