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C4 - Introduction à la Bactériologie Médicale...

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CBH – cours n°1 - 06/09/17

Introduction à la Bactériologie Médicale Introduction La bactériologie a débuté avec l’observation des micro-organismes par Anthony van Leeuwenhock, l’inventeur du microscope au XVIIe siècle, il observe les bactéries mais ne fait pas le lien entre bactérie et infection clinique. Ce sont les travaux plus récents de Louis Pasteur et Robert Koch qui permettent de faire le lien entre bactérie et infection. Dans les années 1990, l’invention de la PCR et des techniques de biologie moléculaire permettent de mieux connaître les virus et leur génome. Charles Nicolle (1866-1936) travaillait sur la biologie, la bactériologie, les parasites... Il a notamment travaillé à Rouen sur la diphtérie, la syphilis et la tuberculose. En Tunisie, il a eu le prix Nobel pour ses travaux sur la toxoplasmose et le typhus. La microbiologie médicale est l’étude des micro-organismes responsables d’infections chez l’Homme. Dans les spécialités de la microbiologie, on retrouve :  la bactériologie qui étudie les bactéries (micro-organisme unicellulaire appartenant à un règne autonome, observation au microscope optique)  la virologie qui étudie les virus  la mycologie qui étudie les levures et les champignons  la parasitologie qui étudie les parasites => ex : Tænia ou le pou (ectoparasite) Pour se développer, la bactérie a besoin d’un réservoir qui peut être humain (méningocoque : méningite), animal, environnemental (eau, sol, aliments). Puis à partir du réservoir, il y a transmission : directe ou indirecte. -

Pour la directe : par contact d’Homme à Homme, transmission aérienne (méningocoque), digestive, manuportée (donc cutané), sanguine, sexuelle, verticale (de la mère à l’enfant in-utéro). Pour l’indirecte : par un animal (zoonose), par un vecteur (comme un insecte ou objet inerte), par l’environnement (eau, air, sol)

-

La transmission définit l’épidémiologie d’une maladie infectieuse.

-

Maladie sporadique : transmission rare et épisodique, cas isolés sans rapport entre eux Maladie endémique : transmission facile, expression permanente mais avec quelques cas Maladie épidémique : très contagieuse, plusieurs cas dans un temps donné sur un territoire limité Maladie pandémique : dissémination rapide à l’échelle d’un continent ou mondiale

Pour les transmissions aériennes, il peut y avoir transmission directe (tuberculose par postillons) ou indirecte (légionellose : à partir d’un réservoir environnemental : l’eau de douche ou climatisation non transmise d’homme à homme). Les transmissions peuvent être digestives, dans le cas de E.coli, le réservoir est constitué par des bovins => se trouve dans la viande insuffisamment cuite, engrais : bouse de vache sur les cultures biologiques. Infection humaine transmise par voie alimentaire (diarrhée avec risque de complication : syndrome hémolytique et urémique SHU) La voie de transmission peut être multiple. Par exemple, le cholera peut être transmis par péril fécal (fèces des patients vont contaminer l’eau, la nourriture, les mains des autres...). C’est une transmission manuportée.

I-

Maladie infectieuse 1. Suspecter l’infection

Transmission :  

Sporadique : isolé Epidémie : contamination Page 1 sur 7



Endémique : stable

Signes d’infection :  

Cliniques : signes généraux (fièvre, frissons, fatigue générale…), signes locaux (dépendent du foyer de l’infection : rougeur, inflammation), syndrome infectieux, choc septique (hypo-tension artérielle) Biologiques : polynucléose (augmentation des globules blancs, dont les neutrophiles ; ce qui est moins le cas pour le virus), anémie de type inflammatoire (diminution des globules rouges dans le sang), VS (vitesse de sédimentation), CRP (plus spécifique des infections bactériennes)

2. Mener l’enquête     

Faire des hémocultures : circulation de la bactérie dans le sang qui donne des métastases septiques Rechercher un foyer : site opératoire ; urines, poumon, voies biliaires ; matériel : cathéter, sonde, valve, prothèse Prélever le foyer suspect Interpréter les résultats biologiques : présence de leucocytes (anormal dans liquide cephalo-rachidien), de protéines, diminution du glucose (bactérie consomme le sucre), présence de bactéries Inf. bactérienne : rechercher des localisations secondaires = métastases septiques (passage de l’infection dans la circulation générale).

Exemple : Méningite : suspicion clinique : vomissements, céphalées, fièvre, photophobie, nuque raide, somnolence, tétanie, douleurs musculaires => hémoculture/ponction lombaire Augmentation du nombre de leucocytes et protéines et diminution de la glycorachie (la bactérie se nourrissant du sucre). La Glycorachie normale est de 60% de la glycémie. Les bactéries appartiennent au règne des protistes, ce sont des micro-organismes unicellulaires appartenant à un règne autonome. Virus et bactéries sont des micro-organismes unicellulaires appartenant à un règne autonome, ils sont procaryotes, n’ont pas de compartimentation nucléo-cytoplasmique ni de mitochondrie Enfin, les levures et les parasites sont des eucaryotes. Ce qui les distingue :  une grande différence de taille, les bactéries sont plus grosses que les virus  les bactéries ont de l’ADN et de l’ARN, tandis que les virus ont soit l’un soit l’autre,  et les bactéries ont une multiplication autonome et asexué alors que les virus ont besoin d’un parasite cellulaire obligatoire pour se multiplier, il a besoin d’une cellule hôte.  Les levures et les parasites ont de l’ADN et de l’ARN, une multiplication autonome sexuée chez les champignons et les parasites.  Les bactéries peuvent être intra ou extracellulaire  Les parasites peuvent être de toute taille, les bactéries sont visibles en MO, les virus sont visibles en ME. Un parasite est un micro-organisme eucaryote qui se caractérise par un cycle de vie, soit avec un seul hôte c’est un parasite monoxène, soit il en a plusieurs c’est un parasite hétéroxène, il est également caractérisé par un vecteur de transmission. Il peut être à la surface de l’organisme, c’est un ectoparasite, ou à l’intérieur, c’est un endoparasite. Il y a des parasites unicellulaires avec les protozoaires (plasmodium [paludisme], toxoplasma, amibes) et les champignons (levures, filamenteux : dermatophytes), mais aussi des parasites pluricellulaires avec les helminthes (vers, tenia) et les arthropodes (acariens [gale] et insectes [pou]). Un virus est un virion procaryote intracellulaire obligatoire, on les classe selon leur type d’acides nucléiques (ADN/ARN), monocaténaire ou bicaténaire, la présence ou non d’une capsule (capside protéique) qui en font un virus enveloppé ou nu, puis on les sépare en différentes familles : herpes virus, pharyngites, H1V1 (SIDA), enterovirus (polio, méningite), rougeole, influenzae (grippe), papillomavirus, poxvirus, adenovirus.

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La structure des virus est visible en microscopie électronique. Le rôle de l’enveloppe est important dans le cycle réplicatif du virus : fusion de sa membrane avec celle de la cellule. Sans enveloppe, c’est un processus d’endocytose. Cycle réplicatif du virus : attachement à la cellule hôte, pénétration, décapsidation, réplication, assemblage, libération. C’est la cellule hôte qui va fabriquer 100 à 1000 virus.

II-

Bactéries

Les bactéries sont des micro-organismes unicellulaires, procaryotes, qui appartiennent au règne des protistes, à multiplication autonome et asexuée, extra- ou intracellulaire, classées selon leur forme : ronde = Cocci ou allongée = Bacille, ou encore selon leur paroi : coloration de Gram (Gram - : rose et Gram + : violette) ce qui permet d’adapter les antibiotiques.

1. Flore Bactérienne (microbiote) Les bactéries nous entourent, certaines sont dans la nature, ont un rôle dans la destruction des déchets et peuvent former un biofilm sur des objets, ce sont les bactéries saprophytes. Les bactéries commensales sont les bactéries qui vivent sur un hôte, sur les flores cutanées, ORL, flore conjonctivale, génital et digestive. Les bactéries de la flore commensale ont un rôle de barrière (empêche d’autres bactéries de coloniser le lieu), de maintien de pH (empêche le développement de levures => mycoses vaginales) et de fermentation. Les bactéries des flores peuvent devenir pathogènes, on parle d’infections opportunistes à l’origine d’infections endogènes surtout quand l’hôte est fragilisé, par effraction cutanée, patient immunodéprimé, etc… Sur le cuir chevelu, les bactéries infectent les cicatrices chirurgicales lors de la trépanation. Il y a une flore sur toutes les muqueuses, comme la muqueuse conjonctivale, la muqueuse vaginale... Il y a une abondance dans la flore oro-pharyngée, dans l’estomac malgré le pH, et plus on descend en distal dans le tube digestif, plus la quantité bactérienne augmente.  Le creux axillaire et le périnée sont les deux sites de prédilection des staphylocoques. Les bactéries de la flore commensale peuvent provoquer des infections nosocomiales. L’infection d’un patient peut être provoquée à l’hôpital par une bactérie exogène, c’est une infection iatrogène, mais un patient peut s’infecter à l’hôpital avec ses propres bactéries, il s’agit toujours d’une infection nosocomiale. Une infection nosocomiale n’est pas toujours liée à de l’iatrogénie (provoqué par une erreur d’hygiène). Une fois le patient infecté, il faut être prudent pour ne pas transmettre la bactérie à un autre patient. Infections liées aux soins : 3% des décès hospitaliers, 4 200 décès/an.

2. Pathogénicité des Bactéries Les saprophytes commensales sont des pathogènes opportunistes, contrairement aux pathogènes spécifiques qui sont facultatifs (partage sain possible) ou obligatoires qui seront toujours à l’origine d’infections. La pathogénicité dépend également des facteurs de virulence et de la défense de l’hôte : avec la barrière physique (peau, muqueuse), la barrière chimique (enzymes), la barrière biologique = flores commensales, les réactions inflammatoires non spécifiques (PNN), l’immunité spécifique cellulaire (lymphocytes T) ou humorale (anticorps). Chez le patient hospitalisé, des bactéries peu virulentes (comme les staphylocoques de la peau) deviennent opportunistes. Les facteurs de virulences sont nombreux : 

on retrouve la mobilité bactérienne, des bactéries sont ciliées en ciliature polaire avec un déplacement en flèche ou en ciliature péritriche avec un déplacement désordonné. La mobilité peut être étudiée in vitro. Exemple clinique de la mobilité des bactéries, l’infection urinaire ascendante avec E. Coli.

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

Autre facteur de virulence, l’adhésion bactérienne, pour E. Coli aux cellules uro-épithéliales aux récepteurs glycoprotéiques P. Fimbriae,



et la multiplication bactérienne se fait en général à 37°, température optimale.



Autre facteur de virulence, les endotoxines, toxines excrétées par la paroi des bactéries, les bactéries Gram– ont toujours une membrane externe dont certains fragments sont libérés au cours d’une infection provoquant un choc septique . Elles sont sécrétées par certaines bactéries, ça concerne le choléra, le botulisme et le tétanos. Ces sécrétions d’exotoxines sont responsables d’éruptions (streptocoques), de gangrènes (staphylocoques) et de paralysies neuromusculaires (Clostridium tetani puisque la toxine se fixe directement au niveau de la synapse, de la jonction neuromusculaire). On peut trouver des exotoxines : certaines bactéries sécrétrices (choléra, tétanos, botulisme).

Dans les infections communautaires : facteurs de virulence importants car hôte immuno-compétent. Dans les infections nosocomiales : manque de défense de l'hôte car bactéries peu virulentes deviennent pathogènes, opportunistes.

3. Anatomie de la Bactérie La bactérie a pour appendices externes, les flagelles/cils pour la mobilité de la bactérie, les Pili ou Fimbriae pour l’adhésion et les Pili sexuels pour l’échange de matériel génétique par l’intermédiaire d’un plasmide. Les enveloppes bactériennes sont formées d’une capsule polysaccharidique, c’est facultatif, toutes les bactéries n’en ont pas, elles interviennent dans l’adhésion, la résistance à la phagocytose et la fonction antigénique. Les enveloppes bactériennes sont formées d’une paroi de peptidoglycanes, des macromolécules de chaînes de glycanes reliées de ponts peptidiques, essentiels et obligatoires, qui déterminent la forme sphérique (=cocci) ou cylindrique (=bacille). Ils ont un rôle de captage et de rejet par des pompes à efflux. L’arrêt de synthèse du peptidoglycane entraîne l’autolyse bactérienne, c’est pourquoi c’est la cible de certains antibiotiques (pénicillines. La pénicilline empêche les bactéries de fabriquer leur paroi => Mort de la bactérie). Cette paroi est à la base de la coloration de Gram,  

pour une paroi épaisse c’est une bactérie Gram + pour une paroi mince c’est une bactérie Gram -

Pour l’étude à la coloration de Gram : • on dépose la bactérie sur une lame, • on la colore au violet de gentiane, • on décolore à l’alcool : si la préparation reste violette alors c’est une bactérie Gram +, si la préparation perd sa teinte violette alors c’est une bactérie Gram -, • on contre-colore à la fuchsine pour les observer au microscope et étudier leurs formes (cocci ou bacille). NB : L’éthanol traverse uniquement la paroi des bactéries à Gram négatif (dissolution des lipides de la membrane externe) et décolore le cytoplasme. En coupe, la paroi d’une bactérie Gram + a une paroi épaisse, le peptidoglycane représente 90% de la paroi. Entre le peptidoglycane et la membrane plasmique, on trouve l’espace péri-plasmique où agissent les antibiotiques. Pour une bactérie Gram-, on retrouve un peptidoglycane mince 10% de la paroi, une membrane plasmique, une membrane externe supplémentaire qu’il n’y a pas chez les bactéries Gram + qui se comporte comme une endotoxine qui provoque l’état de choc septique, elle est constituée de lipo-polysaccharides et de porines qui permettent le passage des nutriments et des antibiotiques, et entre les deux membranes externe et plasmique, on retrouve un espace péri-plasmique et une légère couche de peptidoglycane. Page 4 sur 7

La membrane cytoplasmique possède des enzymes du métabolisme énergétique et a un rôle dans la division par scissiparité. Capsule  paroi  membrane cellulaire

Dans les constituants internes : o

o

o

le chromosome est unique et circulaire, compacté, il n’y a pas de membrane nucléaire, environ 5 000 pb et moins de 500 gènes, il se duplique au cours de la division cellulaire. Les plasmides sont circulaires doués d’autoréplication, facultatifs, certains gènes plasmidiques peuvent s’intégrer au chromosome alors dans ce cas ce sont des transposons, ils sont porteurs de gènes, notamment de gènes de résistance aux antibiotiques (ex : gènes de pénicillinases), et permet la propagation entre bactéries par conjugaison. Les ribosomes permettent la synthèse des protéines à partir des ARNm.

4. Classification des Bactéries Dans les Bactéries aérobies, •

Gram + : ◦ Cocci : Staphylocoques en grappe de raisin, Streptocoques, Entérocoques et Pneumocoques en chaîne. ◦ Bacille : Listeria, Corynébactéries Bacillus

•

Gram - : ◦ Cocci : Neisseria (méningocoque ou gonocoque) ◦ Bacille : Entérobactéries (fréquent++), Pseudomonas, Haemophilus.

Les Bacille à Gram – et les Cocci à Gram + sont les bactéries les plus fréquemment rencontrées en clinique. Les bactéries anaérobies sont les partenaires fréquents des bactéries aérobies (ex : gangrène). Les bactéries anaérobies sont présentes dans les flores et certaines dans l’environnement (spores). Il existe des bactéries non colorables par le Gram : o

o

Les bactéries spiralées avec Treponema pallidum à l’origine de la Syphilis, elle est non cultivable et difficile à étudier en diagnostic, on fait un diagnostic sérologique en recherchant les anticorps. On retrouve aussi des mycobactéries avec Mycobacterium tuberculosis à l’origine de la Tuberculose, qui a une coloration particulière et dont la culture est longue.

5. Mode de Vie : Biofilm bactérien Les bactéries fabriquent un glycocalyx, des polysaccharides bactériens, et ils permettent leur adhésion les uns avec les autres, formant un film, puis des microcolonies, une synthèse de polysaccharides, puis une dispersion de bactéries à partir de cette microcolonie pour aller adhérer plus loin et recommencer le même processus et les mêmes étapes.

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Le biofilm bactérien permet l’adhésion à l’environnement, à la plaque dentaire, les sondes et les cathéters, etc… Le traitement de ces biofilms bactériens est difficile car si leur métabolisme est déjà ralenti ça marche moins bien et il faut que l’antibiotique pénètre le biofilm. Il est accessible quand il s’agit d’un cathéter ou d’une sonde urinaire… Mais beaucoup moins quand il s’agit sur une prothèse de hanche. Concernant la sporulation bactérienne, en conditions défavorables la bactérie prend une forme sporulée, tandis qu’en conditions favorables la bactérie prend une forme végétative. C’est une forme de survie, elle possède un génome condensé et un cytoplasme déshydraté. Ex : Infections d’origine tellurique : Tétanos (Clostridium tetani) et la Gangrène gazeuse (Clostridium perfringens).

6. Importance du Prélèvement Eviter la flore commensale : • désinfection cutanée, • désinfection du méat urinaire, • prélèvement des urines en milieu de jet pour éviter la contamination du début de jet, • flore commensale de profondeur plus intéressante que la flore commensale de surface (ex : cicatrice). Tenir compte de la fragilité des germes : • conservation dans des milieux spécifiques, • on privilégie la ponction plutôt que l’écouvillon pour les urines, • l’acheminement doit être rapide. Il faut savoir ce que l’on cherche et le préciser. Par exemple pour les bactéries à croissance lente (ex : tuberculose), il faut prévenir le bactériologiste pour qu'il étudie l’échantillon plus longtemps ! Il est également important de donner des informations cliniques en cas de traitement antibiotique ou de terrain particulier (ex : immunodépression ou grossesse). Un prélèvement particulier : les hémocultures. • Quand la réaliser ? En cas de fièvre ou hypothermie, de choc septique ou de suspicion d’endocardite. • Comment la réaliser ? Sur prescription, par ponction veineuse, parfois sur cathéter, avec asepsie cutanée. • Combien de fois ? Par deux séries d’hémocultures à 1h d’intervalle ou par des études de garde au labo en urgence (délai de positivité).

7. Etapes du Diagnostic Bactériologique J1 : Examen direct au Gram, cytologie et mise en culture. Il faut beaucoup de bactéries pour pouvoir établir un diagnostic, sinon on met le prélèvement en milieu solide et partout où il y a une bactérie on observera une colonie avec 106 bactéries, sinon on met le prélèvement en milieu liquide pendant 18h et à 37° alors le liquide devient trouble. J2 : Observation des cultures, Gram sur les colonies. Identification des différentes espèces bactériennes à l’aide d’appareils de spectrométrie de masse ou des galeries biochimiques + antibiogramme à partir d’une suspension bactérienne, on transplante en nappe une gélose dans une boîte de pétri pour étudier la réaction des bactéries au contact des antibiotiques, et incubation pendant 12h minimum. J3 : Résultat de l’identification, lecture de l’antibiogramme, puis adaptation de l’antibiothérapie à 48h ! Dès la prise en charge du patient, on traite le patient par une antibiothérapie probabiliste juste après les prélèvements, pendant 48h-72h puis suite aux résultats bactériologiques on modifie éventuellement l’antibiothérapie pour l’adapter en fonction de la bactérie visée. Spectrométrie de masse maldi-tof : Arrivent d’abord les petites protéines puis les grandes. On compare le spectre obtenu avec la banque de données.

8. Outils Molé...