Cap. 1 Cinetica Microbiana PDF

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Apuntes de Cinética microbiana para el diseño de biorreactores.
Profesor. Rangel de León...

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Capítulo 1 1. CRECIMIENTO MICROBIANO Y CINÉTICA DE FERMENTACIONES. 1.1. INTRODUCCION. En la actualidad una gran variedad de productos son elaborados por vía “fermentativa” o “microbiana”. En un principio, los microorganismos se aislaban y seleccionaban de una gran variedad de fuentes (suelos de distintos tipos, materiales orgánicos en descomposición, aguas, etc.), sin embargo, gracias al extraordinario avance de la microbiología, la bioquímica y la genética, existen ahora “Colecciones Microbianas” que se encargan de preservar, por tiempos prolongados, las características de producción de microorganismos de interés industrial. El avance ha llegado a grado tal que se cuenta con microorganismos mejorados o “producidos” genéticamente, en manera tal que los rendimientos y capacidades de producción en los bioprocesos se han incrementado notablemente. Definiremos como “fermentación” a todo aquel proceso a través del cual, algún género microbiano, transforma una materia prima orgánica en un producto de interés industrial. Así, la transformación de azúcares disueltos a etanol por acción de las levaduras (transformación anaeróbica) o la producción de antibióticos por la acción de hongos sobre almidones y otras materias primas disueltas, se consideran procesos de fermentación y específicamente de fermentación “sumergida”. No es el objetivo de la presente obra abarcar el campo de las fermentaciones en sustrato sólido, sino exclusivamente las sumergidas. Un proceso de fermentación consta de tres etapas principales que son: a) preparación de las materias primas; b) transformación microbiana de la materia prima a producto; c) separación, recuperación y purificación de producto(s). La primera etapa concluye con la preparación de un “medio de cultivo acuoso” que sea capaz de sostener la vida y la capacidad productiva del microorganismo de interés a la mayor velocidad posible. Dicho medio deberá contener los elementos necesarios e indispensables para el crecimiento y producción, por lo que deberá diseñarse respondiendo a estas características. En esta etapa deberán considerarse los efectos que las variables fisicoquímicas de los medios tales como densidad, pH, fuerza iónica, etc., presentan sobre el crecimiento y producción microbiana. La “transformación de la materia prima” se refiere a la acción microbiana sobre el medio de cultivo para elaborar el producto de interés. En esta etapa, además de los aspectos fisicoquímicos del proceso de transformación, cobran importancia los aspectos físicos o de índole “ambiental”, tales como velocidades de transferencia de masa y de calor, valores de pH y temperatura, etc. La transformación de la materia prima se lleva a cabo en recipientes adecuados denominados “fermentadores”, “biorreactores” o simplemente “reactores”. Existen multitud de formas, tipos y tamaños; los hay de pocos litros de volumen hasta de cientos

de metros cúbicos, construidos en materiales tales como vidrio, acero al carbón, acero inoxidable, etc. Cuentan con dispositivos para agitación del medio de cultivo. Operan en régimen por lote, continuo o semicontinuo. Se puede adicionar al medio de cultivo, en forma aséptica, aire, ácidos, antiespumante u otros líquidos. La principal función de un fermentador es proporcionar y mantener las condiciones “ambientales” impuestas por el sistema biológico para la transformación óptima y económica de las materias primas a productos. La fermentación se inicia con la “inoculación” del medio de cultivo con el microorganismo de interés. El inóculo consiste de un volumen determinado de medio de cultivo en el que se ha crecido previamente dicho microorganismo. La relación del volumen de inóculo a volumen de fermentación oscila normalmente entre el 5 y 10% v/v. En un proceso por lote, la fermentación termina hasta que la casi totalidad de la materia prima es transformada a producto, el cual puede ser la biomasa misma, un metabolito primario o uno secundario. El objetivo de toda fermentación industrial es maximizar dicha transformación en el menor tiempo posible. En una fermentación ocurren distintas reacciones bioquímicas complejas. La caracterización de cualquier proceso de fermentación en el que los microorganismos consumen las materias primas para reproducirse, mantenerse y formar productos, requiere necesariamente del conocimiento de la estequiometría del proceso, de la relación entre las materias primas y energía involucradas y de los rendimientos celulares. En consecuencia, es necesario determinar, entre otras cosas, las distintas velocidades que ocurren en el proceso (de crecimiento celular; de consumo de sustrato; de síntesis del producto; de producción de calor; etc.), de tal forma que sea posible tanto la predicción del comportamiento celular con fines de control, como el diseño, construcción o implementación del equipo de fermentación.

1.2. CRECIMIENTO MICROBIANO. La evolución de una población microbiana en pleno crecimiento se ajusta a las leyes de la cinética clásica de evolución poblatoria. Antes de describir dicha cinética, se explicará el concepto "crecimiento celular". Como todo ser vivo, los microorganismos nacen, crecen, se reproducen y mueren. Para que un microorganismo dé origen a otro, debe “crecer individualmente” hasta llegar a un estado de madurez fisiológica que le permita la reproducción. Desde este punto de vista, debe distinguirse entre "crecimiento individual" y "crecimiento poblacional", este último es consecuencia del primero. En un cultivo microbiano debe distinguirse el crecimiento "sincrónico" del "asincrónico", el primero indica una división o reproducción de todos los individuos de una población a un mismo tiempo y el segundo a una división o reproducción azarosa, con respecto al tiempo, de los individuos que componen a la población. El crecimiento sincrónico se da bajo ciertas condiciones especiales de cultivo. Otro concepto igualmente útil es el denominado crecimiento "balanceado" o "desbalanceado", en aquél ocurre que las velocidades de formación de los componentes celulares (carbohidratos, lípidos, proteínas, etc.) conservan una proporcionalidad mantenida con respecto al tiempo, mientras que en el desbalanceado, al menos un componente no conserva dicha proporcionalidad1. En una fermentación industrial, el crecimiento usualmente es evaluado como "crecimiento poblacional asincrónico" y generalmente ocurre en forma balanceada (además del detrimento en la economía, es irrelevante cuantificar el crecimiento individual, lograr una sincronía y desbalancear el crecimiento). Los requisitos fundamentales para que se de el crecimiento son dos: i) la existencia de un medio de cultivo que aporte los elementos nutritivos en todas sus formas (fuentes de C, 2

N, S, P, O, etc.); ii) el establecimiento y mantenimiento de las condiciones fisicoquímicas o ambientales necesarias (temperatura, pH, fuerza iónica, potencial redox, etc.). Con base en estos requisitos se puede establecer una clasificación de los distintos tipos de microorganismos. Así por ejemplo, desde el punto de vista en que los microorganismos obtienen la energía para su crecimiento se pueden clasificar en autótrofos y heterótrofos; los autótrofos la obtienen a partir de fuentes de carbono inorgánicas (CO, CO2, carbonatos, etc.) y los heterótrofos a partir de fuentes orgánicas tales como carbohidratos, lípidos, aminoácidos, etc. Otra clasificación se basa en el consumo de un nutriente específico; el oxígeno: los microorganismos que lo consumen durante y para su crecimiento se denominan aerobios, mientras que los que crecen en su ausencia se denominan anaerobios. Desde el punto de vista de las condiciones ambientales, los microorganismos pueden clasificarse de acuerdo a su temperatura y pH óptimos de crecimiento (psicrófilos, mesófilos y termófilos; acidófilos, neutros o alcalinófilos)2. Desde un punto de vista industrial y con base en los distintos tipos de productos obtenidos por vía fermentativa (bebidas alcohólicas, alimentos fermentados en todas sus variedades, antibióticos, enzimas, bioplagicidas, interferón, insulina humana, etc.), los microorganismos más importantes y con mayores perspectivas económicas son los heterótrofos, aeróbicos, mesófilos, aunque los que han repercutido mayormente en beneficio de la humanidad han sido sin duda los heterótrofos, anaeróbicos mesófilos. 1.2.1. LAS FUENTES NUTRICIAS. La selección de las fuentes nutricias componentes de un medio de cultivo para la producción de un metabolito de interés, dependerá, entre otras cosas, del tipo de microorganismo; de la finalidad de la producción (fines comerciales o no); de si se requiere de una rápida velocidad de crecimiento; del valor agregado del producto; etc. Por esta razón, solo se hará breve mención de las distintas fuentes que se han utilizado a escala industrial, sin entrar en detalle de las particularidades establecidas por la investigación básica para la selección de sus materias primas. 1.2.1.1. FUENTE DE CARBONO. Todas las fuentes nutricias son importantes, sin embargo, debido a la naturaleza orgánica del proceso fermentativo, la fuente de carbono (FC) es la más relevante. El carbono contenido en la biomasa, en el producto o productos y en el bióxido de carbono producido, provienen de dicha fuente. De aquí su importancia. Puesto que las materias primas representan del 30 al 50% del costo de producción3, es muy importante la selección adecuada de la FC. Entre las más comúnmente usadas se encuentran los carbohidratos en sus distintas formas: hexosas (glucosa, fructosa, galactosa, etc.); pentosas (xilosa, arabinosa y ribosas); disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa, etc.) y polisacáridos (almidones, celulosas, hemicelulosas, etc.). Una fuente muy importante de carbohidratos es la melaza (de caña o de remolacha), la cual contiene cantidades significativas de vitaminas, factores de crecimiento, micronutrientes y cantidades pequeñas de nitrógeno orgánico; por estas características y por ser un subproducto de la industria azucarera, las melazas son una muy buena opción para la industria de fermentaciones. Algunos otros subproductos utilizados como fuentes de carbono son: suero de leche, licores sulfíticos, vinazas, etc. Entre las características más importantes que debe reunir una FC para utilizarse en un proceso fermentativo a escala industrial, se encuentran las siguientes: i) abundante; ii) disponible; iii) de bajo costo; iv) de producción centralizada; v) alta miscibilidad en agua; vi) parcialmente oxidado; vii) de fácil degradación por parte del microorganismo; viii) que muestre altos rendimientos de producto. 3

1.2.1.2. FUENTE DE NITROGENO. Después del carbono, el nitrógeno es el elemento que normalmente se encuentra en mayor concentración en el medio de cultivo . Se utiliza en la síntesis de aminoácidos, de proteínas, de purinas y pirimidinas (constituyentes de los ácidos nucleicos), etc. Las fuentes de nitrógeno (FN) generalmente se pueden clasificar en orgánicas e inorgánicas. Entre las orgánicas sobresalen el agua de cocimiento de maíz, harinas de pescado y de soya, hidrolizados de proteínas, etc.; mientras que en las inorgánicas sobresalen la urea, nitratos, nitritos, sales de amonio y amoniaco líquido o gaseoso (en ciertos casos el amoniaco, al usarse como FN, sirve como agente controlante del pH de fermentación). La selección de esta fuente sigue los mismos criterios establecidos para la FC. 1.2.1.3. FUENTES DE MACRO Y MICROELEMENTOS. Los demás elementos necesarios para el crecimiento se pueden clasificar en macro y microelementos, los primeros comprenden al fósforo, azufre, calcio, magnesio, hidrógeno y oxígeno. Estos dos últimos muy particulares, el hidrógeno, por ejemplo, generalmente es tomado por el microorganismo con la fuente de carbono, mientras que el oxígeno, necesario para la respiración, tiene que ser adicionado al medio con el aire. Entre los microelementos o micronutrientes (los que se requieren en muy pequeñas concentraciones) se encuentran el fierro, zinc, manganeso, cobre, vitaminas, etc. Los rendimientos de varios metabolitos primarios y secundarios se ven afectados por los microelementos. Estos son importantes por distintas razones, entre las que se pueden mencionar las siguientes: i) regulan las propiedades electrolíticas y osmóticas del interior de las células; ii) actúan como cofactores de algunas enzimas importantes; etc. A diferencia de un medio de cultivo preparado en el laboratorio y a utilizar en la investigación básica, en el que normalmente se utiliza agua destilada (o bidestilada) y sales químicamente puras, en la preparación de un medio de cultivo industrial, frecuentemente se requiere la adición de los macronutrientes pero no la de los micronutrientes, ya que estos pueden ser satisfechos a través del agua de proceso (de la red municipal, pozos, manantiales, lagos o ríos) o a través de las materias primas que no son químicamente puras. 1.2.1.4. FUENTE DE OXIGENO. Este nutriente es muy importante para las fermentaciones aeróbicas. A diferencia de los demás, el oxígeno se tiene que estar suplementando continuamente en el medio por dos razones principales: I) por el consumo por parte de los microorganismos (un cultivo en pleno desarrollo puede consumir en pocos segundos 14 mg de oxígeno por litro); II) por su baja solubilidad en medios de cultivo (no mayor a 14 ppm). La fuente común de oxígeno en una fermentación es el aire, que por lo general se burbujea en el medio de cultivo desde el fondo del fermentador. La transferencia de oxígeno desde las burbujas del aire hasta el microorganismo, es una de las principales limitantes de la productividad en una fermentación, por lo que el biorreactor debe ser diseñado para satisfacer la máxima demanda por parte del m.o.

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1.3. RENDIMIENTOS Y COEFICIENTES DE MANTENIMIENTO. Uno de los parámetros indicativos de la eficiencia de conversión en una fermentación es el "rendimiento", el cual es una relación "masa/masa" de dos variables. El rendimiento celular con base en el sustrato (Yx/s) representa la cantidad total de masa celular que se produce por unidad de masa total de sustrato que se consume. En una fermentación en la que los nutrientes del medio de cultivo son transformados a biomasa, productos o simplemente "quemados" por el microorganismo, se pueden establecer distintos rendimientos: celular con base en el sustrato (Yx/s); de producto con base en el sustrato (Yp/s); celular con base en el oxígeno (YO2); etc. Yx/s = g de células producidas/g sustrato consumido = x/s. Yp/s = g de producto sintetizado/g sustrato consumido = p/s. YO2 = g de células producidas/g de oxígeno consumido = x/O2. El término “s” representa la cantidad total de sustrato consumido, el cual es la suma de la cantidad de sustrato que se utiliza para el crecimiento celular (s)x, la cantidad de sustrato que se utiliza para el mantenimiento celular sin que exista crecimiento (s)m y la cantidad de sustrato que se utiliza para la formación de producto (s)p. Desde este punto de vista y con fines de distinción, los rendimientos anteriores se denominarán como “rendimientos globales”.

en la que:

Y x/s = (x, O2 o p)/(s)

(1)

(s) = (s)x + (s)m + (s)p

(1a)

Cuando el producto solo es la biomasa crecida y el consumo de sustrato para mantenimiento es cero, la relación x/s se denomina como "rendimiento celular para crecimiento verdadero" (Yx/s)g. La relación entre ambos rendimientos se muestra en la siguiente ecuación:

m 1 1   s Yx / s (Yx / s )g 

(2)

en la que "ms" es el coeficiente de mantenimiento celular (que representa la cantidad de sustrato que debe ser consumido por unidad de masa celular por unidad de tiempo, para fines de mantenimiento celular sin que exista crecimiento) y "" es la velocidad específica de crecimiento4. Arreglando la ecuación (2) se puede llegar a:

 Yx / s

 Qs 

 ( Yx / s ) g

 ms

(2a)

En la que Qs es la velocidad específica de consumo de sustrato. Así como existe el coeficiente de mantenimiento y el rendimiento para crecimiento verdadero para el sustrato, existirá igualmente uno para cada uno de los nutrientes [para el oxígeno, por ejemplo, "mO2" y "(YO2)g". En la literatura se pueden encontrar valores de rendimientos y de coeficientes de mantenimiento para distintos microorganismos, creciendo en distintas fuentes de carbono y bajo distintas formas de cultivo1,4,5,6,8,17. Otros rendimientos de importancia en algunos procesos fermentativos son el rendimiento celular con base en los electrones disponibles en el sustrato (Yav.e) y el rendimiento celular basado en la energía total disponible (Ykcal). 5

a) Yav.e .Rendimiento celular con base en los electrones disponibles en el sustrato (el subíndice "av" se refiere al término “disponible” traducido del inglés). Para determinar el número de electrones disponibles en un sustrato dado, se determina la cantidad de oxígeno necesaria para su combustión y se multiplica por 4 (4 electrones requeridos para la reducción de una molécula de oxígeno): este valor se denomina Yav.e/s, por lo tanto:

Yav .e 

Yx / s Yav .e / s

Ejemplo:

(3) C6H12O6 + 6O2

6CO2 + 6H2O

Para oxidar la glucosa se requieren de 6 moles de oxígeno, por lo que el Yav.e/s será de 6 x 4 =24 av.e/mol de glucosa. Y si el rendimiento celular (Yx/s) de Penicillium chrysogenum en glucosa es de 0.43 g/g, entonces: Yav.e = 0.43x180/24 = 3.22 g células/av.e b) Ykcal. Rendimiento celular basado en la energía total disponible en el medio, el cual queda definido como:

Yk c a l 

x  H a * x   H c

en la que:

(4a)

o

Ykcal 

1  Hc Ha  x

(4b)

Ykcal = g biomasa producida/kcal disponible Ha = calor de combustión de la biomasa = 5.3* kcal/g de células. Hc = calor generado por el catabolismo [=] kcal/l. *) De acuerdo con los análisis calorimétricos se ha propuesto el valor de

Ha mostrado. El denominador de la ecuación "4b" es la energía total disponible, es decir, la incorporada al material celular y la gastada por el catabolismo. El valor de Hc para procesos totalmente aeróbicos en medios complejos y en ausencia de formación de productos, puede calcularse multiplicando el oxígeno consumido"O2" por la cantidad de energía disponible por la reducción del oxígeno "HO" (106 kcal/mol). Hc = O2 * HO

Ykcal 

1  Ha   HO / YO 2

en la que:

(5) (6)

HO = generación de calor basada en el consumo de oxígeno (106 kcal/mol de O2). YO2 = rendimiento celular con base en el oxígeno [=] g cel/mol de O2.

Al tomar un valor de 1.0 g cel/g O2 (valor típico) o 32 g cel/ mol O2, se obtiene un valor de Ykcal = 0.1161 g cel/ Kcal disponible. En la Tabla 1 se muestran valores de algunos rendimientos, mientras que en la Tabla 2 se muestran valores típicos del coeficiente de mantenimiento celular con base en el sustrato “ms”.

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Tabla 1 Valores típicos de rendimientos. MICROORGANISMO

SUSTRATO

INDISTINTOS

Glucosa Hidrocarburos Glucosa Glucosa

Candida utilis P. chrysogenum Saccharomyces cerevisiae

Glucosa Candida utilis Acetato Candida utilis Etanol Klebsiella sp. Metanol Methylococcus sp. Metano *) Valores promedios de microorganismos.

Yx/s (g/g) 0.5* 1.0* 0.53 0.43

Yo2 (g/g) 1.0* 0.5* 1.37 1.35

Ykcal (g/kcal) 0.126 0.107

0.5 0.36 0.68 0.38 1.01

0.97 0.7 0.61 0.56 0.29

0.123 0.092 0.112 0.081 0.104

Tabla 2. Valores típicos del coeficiente de mantenimiento celular “ms”. MICROORGANISMO Aerobacter cloacae Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae. Klebsiella aerogenes Klebsiella aerogenes

CONDICIONES DE CRECIMIENTO.

“ms” (g/g/h).

Aeróbico. Limitado por glucosa. Anaeróbico. Anaeróbico + NaCl (1.0 Mol) Aeróbico Anaeróbico

0.094 0.036 -0.04 0.36 0.04 0.5

1.4. ESTIMACION DEL CALOR METABOLICO. Como toda reacción bioquímica, el crecimie...