9. Taxonomía microbiana PDF

Preview

Summary

Download 9. Taxonomía microbiana PDF

Description

Tema 9. TAXONOMÍA MICROBIANA TAXONOMÍA La sistemática es el estudio de la diversidad de organismos y relaciones mutuas. Relaciona la filogenia y la taxonomía, en la que los organismos son caracterizados, nombrados ya agrupados conforme a sus relaciones naturales. La sistemática tiene en cuenta la taxonomía, la evolución, la ecología, la bioquímica, la genérica, la biología molecular, la microscopía y la patología. La taxonomía es una caracterización exhaustiva: 1. Clasificación: estructura los organismos en grupos taxonómicos (taxones) en base a su similitud. 2. Nomenclatura: asigna nombres a los taxones. 3. Identificación: determina a que taxones pertenece un organismo que se aísla.

CONCEPTO DE ESPECIE Es la unidad taxonómica básica. Definiciones: •

Grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas.

•

Un grupo monofilético y genómicamente coherente de organismos individuales que muestran un elevado grado de similitud global con respecto a muchas características independientes, y que es diagnosticable por unas propiedades fenotípicas discriminativas.

Una cepa es una población de organismos que desciende de un único organismo. Una cepa tipo corresponde a especímenes que deben mantenerse viables y disponibles para la comunidad científica. Sirven de referencia para la caracterización taxonómica. Cuando una nueva especie de bacteria es descrita en una revista científica, una cepa es designada como el tipo para ese taxón, con vista a futuras comparaciones taxonómicas con otras cepas de dicha especie. El depósito de esta cepa tipo en las colecciones nacionales de cultivos de al menos dos países, cosa que hace que la cepa sea accesible públicamente, es un prerrequisito para la validación del nombre de la nueva especie. En España tenemos la colección española de cultivos tipo, especializada en bacterias, arqueas, levaduras y hongos (CECT).

El sistema de nomenclatura binomial (Linneo) sugiere que el nombre científico asignado a una especie está formado por la combinación de dos palabras: el nombre del género y el nombre específico. El conjunto de ambos es el nombre científico que permite identificar a cada especie como si tuviera nombre y apellido.

Categorías de clasificación a nivel de subespecie (tipificación) -

Serovariedad o serotipo (antígenos distintos)

-

Biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas)

-

Patovariedad (patogenicidad)

-

Morfovariedad (diferencias morfológicas)

TAXONOMÍA BACTERIANA Clásica. Utiliza caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc) y los pondera ➔ claves dicotómicas. También utiliza caracteres genotípicos como el %G+C o la hibridación DNA-DNA. Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico: 1. Morfología: forma, tamaño y tinción. 2. Movilidad: tipo y disposición del flagelo. 3. Fisiología y bioquímica: aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos, requerimientos iónicos, producción de enzimas extracelulares (catalasa, oxidasa). 4. Metabolismo: fotótrofo, quimioorganotrofo, quimiolitótrofo, utiliación de compuestos de C, N o S, fijación de N. 5. Otros: sensibilidad a antibióticos, análisis de proteínas, luminiscencia. Caracteres fenotípicos: taxonomía numérica. Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos. Se basa en la presencia o ausencia de un gran número de caracteres, teniendo cada tipo de carácter el mismo peso. La similitud es función de la proporción de caracteres comunes. Los caracteres fenotípicos estudiados no deben ser menos de sesenta y para saber el grado de similitud debemos dividir el número de características que coinciden entre el número de características estudiadas. En primer lugar se elabora una tabla con todas las características, se asigna + o – en función de cada caso y después se compara el resultado de cada grupo con el resto. Características genotípicas clásicas -

Contenido en G+C (contenido en GC/contenido en CGAT · 100). En procariotas hay un alto rango (del 24 al 76%) por tanto aporta poca información para para la caracterización taxonómica. El criterio de exclusión es, en general, que si la proporción en GC de dos organismos difiere más del 5% es que comparten pocas secuencias de DNA en común y por lo tanto es poco probable que estén emparentadas. Si el grado de diferencia es mayor del 10% es muy probable que los dos organismos correspondan a géneros diferentes. Sin embargo dos organismos pueden tener proporciones GC idénticas y estar muy poco emparentados, ya que a partir de una composición de bases muy similar se pueden obtener secuencias nucleotídicas muy diferentes.

-

Hibridación DNA-DNA. Cuando dos organismos comparen muchos genes muy parecidos (o idénticos), es de esperar que sus DNA se hibriden el uno con el otro en proporción equivalente a la similitud entre sus secuencias genómicas. De este modo, la medida de la hibridación DNA-DNA entre los genomas de dos organismos proporciona un índice aproximado de su parecido mutuo. Es el criterio actual de definición de especie. Tm es la temperatura a la que el 50% de las cadenas de DNA están desnaturalizadas.

Para realizar un experimento de hibridación el DNA genómico aislado de un organismo se marca radioactivamente con 32P o 3H, se fragmenta en pequeños trozos, se calienta para separar las dos cadenas complementarias y se mezcla con un exceso de DNA del segundo organismo, preparado de modo similar al del primero pero sin marcar. La mezcla de DNA se deja enfriar para que las cadenas simples se reasocien por complementariedad.. El DNA de doble cadena se separa del DNA restante sin hibridar. Después de todo este proceso, se mide la cantidad de radiactividad en el DNA de cadena doble i se compara con el control, cuya medida de radiactividad se toma como el 100%. Si el porcentaje de hibridación entre DNA heterólogos en comparación con DNA homólogos es del 100 al 75 % se considera que los dos organismos pertenecen a la misma especie, si es del 75 al 25 que es del mismo género pero distinta especie y si es menos del 25% probablemente sean géneros distintos. La cuantificación se lleva a cabo por absorbancia. También podemos comparar el grado de similitud comparando la Tm de los dos organismos, si la variación de Tm es menor de 5ºC corresponden a la misma especie.

TAXONOMÍA POLIFÁSICA Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres: -

Fenotípicos: clásicos (morfología, nutrición, etc), marcadores quimiotaxonómicos y perfil de proteínas totales y enzimas.

-

Genotípicos: clásicos (%G+C y hibridación DNA-DNA) y nuevos (fingerprinting: perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN).

-

Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S y genes que codifican proteínas esenciales.

Caracteres fenotípicos. Marcadores quimiotaxonómicos. Clasificación e identificación en base a variaciones químicas determinadas mediante un análisis químico con equipamiento especializado. No son universales, pero son muy útiles dentro de algunos grupos y son presentes en distintos tipos de estructuras celulares por ejemplo en la pared celular hay péptidoglicanos, en la membrana externa de Gram – lipopolisacáridos y en la membrana citoplasmática ácidos grasos, ácidos micólicos y pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas. Por ejemplo, los tipos y proporciones relativas de ácidos grasos presentes en la membrana citoplasmática de dos organismos se comparan para determinar el grado de similitud. ANÁLISIS FILOGENÉTICO Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies). Compara la secuencia de moléculas (cronómetros evolutivos) y establece la relación entre ellas. Las secuencias de las moléculas son el registro histórico de la evolución. Las propiedades de un buen cronómetro evolutivo:

1. No estar influenciados por la HGT (transferencia genética horizontal) para que reflejen realmente las relaciones evolutivas entre microorganismos. 2. Distribución universal: estar presentes en todas las bacterias. 3. Función homóloga en todos los microorganismos. 4. Cantidad de información suficiente: reflejo de la similitud que presentan los genomas completos. 5. Tamaño adecuado. 6. Secuencias con zonas altamente conservadas para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variables. 7. A ser posible existir en copia única en el genoma. ➔ Genes de ARN ribosómico, sobretodo los de 16S y genes housekeeping (se expresan como resultado de la interacción entre la RNApol y el promotor), caracterizados por tener niveles de expresión constante en todas las células y condiciones de un mismo organismo. Árboles filogenéticos Se utilizan programas para alinear secuencias de nucleótidos y compararlos para construir un árbol filogenético. La longitud de la línea entre organismos es proporcional a la distancia evolutiva. La similitud en las secuencias implica similitud en los genes. En primer lugar se alinean las secuencias de los organismos o especies a analizar, y posteriormente se buscan variaciones. Cuanto más distantes estén dos taxones evolutivamente, más diferencias nucleotídicas cabe esperar y por consiguiente mayor distancia génica.

ANÁLISIS DE SECUENCIAS MULTILOCUS (MLSA) Una de las limitaciones del análisis de secuencias de genes de RNA ribosomal es que se centran sólo en un gen. El MLST evita este problema y constituye una técnica muy poderosa para caracterizar distintas cepas dentro de una misma especie. Implica la secuenciación de varios genes de mantenimiento básico celular de un determinado organismo, y comparar sus secuencias con los genes equivalentes de otra cepa del mismo organismo. De cada gen se amplifican por PCR aproximadamente 450bp, que luego se secuencian. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se comparan y se toma nota de las diferencias. Cada diferencia es considerada un alelo del gen y se le asigna un número. Por tanto, a cada cepa se le asignan una serie de números que constituyen su perfil alélico, en otras palabras su tipificación de secuencia multilocus. Dos cepas con secuencias idénticas en un determinado gen tendrán asignado el mismo número alélico para ese gen, y dos cepas con secuencias idénticas para todos los genes tendrán asignado el mismo perfil alélico. El MLST tiene resolución suficiente para distinguir entre cepas muy cercanas. Dos cepas pueden distinguirse en base a un único cambio nucleotídico en uno solo de los genes analizados.

Ventajas: 1. Bajo coste, reproducibilidad intra e interlaboratorio. 2. Capacidad de establecer las relaciones filogenéticas de una manera precisa. 3. Creación de una base de datos. Información accesible a los científicos mediante el depósito de secuencias en bases de datos. Problema: Encontrar la combinación de genes que se pueda aplicar en todos los grupos taxonómicos. Los genes que deben ser utilizados en los estudios de MLSA nunca serán los mismos para todos los taxones y han de establecerse para cada grupo bacteriano. No es útil para comparar organismos más allá del nivel de especie. CRITERIOS UNIVERSALES PARA DESCUBRIR NUEVAS ESPECIES BACTERIANAS 1. El mayor número posible de cepas. 2. Pruebas fenotípicas, diagnósticas y diferenciales. Caracterización morfológica, bioquímica y fisiológica. 3. Análisis filogenético en base al gen 16S rRNA. 4. Hibridación DNA-DNA (si la similitud entre 2 cepas bacterianas en base al gen 16S rRNA es superior al 97%). 5. Secuenciación de 5 genes housekeeping (MLSA). 6. Depósito de la cepa tipo en 2 colecciones cultivo de dos países diferentes.

FILOGENÓMICA El análisis filogenético está basado en homología, esto es, el análisis de secuencias del DNA que están relacionadas por un ancestro común. Una es que se obtiene la secuencia del DNA de un gen, el siguiente paso para desarrollar una filogenia consiste en alinear dicha secuencia con la secuencia de genes homólogos de otras cepas o especies. De este modo se pueden identificar las diferencias entre secuencias, que pueden aportar la información filogenética. El programa BLAST accesible desde http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ realiza alineamientos de modo automático y ayuda a identificar genes homólogos a una nueva secuencia entre los muchos miles de genes ya secuenciados. Las secuencias de homólogos pueden descargarse desde http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank. El primer organismo vivo en ser secuenciado al completo fue Haemophilus influenzae.En noviembre de 2014 en la página hhttp://www.genomesonline.org/ hay secuenciado el genoma de 932 archaeas y 39.967 bacterias....