Ciclo de krebs - Apuntes 8 PDF

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Apuntes ciclo de Krebs - Bioquimica Metabolica, Grado en bioquimica....

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Tema 8 Bioquimica – Ciclo de Krebs. Características: -Es una vía aeróbica cíclica. -Es el eje central del metabolismo celular: Vía común final de la oxidación de H de C, lípidos y proteínas. -Se da en la matriz y la membrana interna mitocondrial. -Es una fuente de precursores para la biosíntesis de: aa, nucleótidos, colesterol, etc. -El lugar donde esta mas activo es el hígado. - Es una ruta cíclica. - A diferencia de la glucólisis transcurre con intermediarios libres no fosforilados (en la glucólisis sus intermediarios no se podían mover porque estaban fosforilados). -Es Totalmente dependiente de oxígeno. - Muchas de sus reacciones necesitan también magnesio (presente en todo el metabolismo). Funciones Principal función del Ciclo: producir energía (GTP = ATP) combinado con la cadena respiratoria Función secundaria: producir metabolitos secundarios para otras vías REACCIÓN GLOBAL: Acetil-CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O ® 2CO2 + 3NADH+H+ + FADH2 + GTP + CoA

Producción del acetil-CoA (acetato activado). Antes de entrar al ciclo de Krebs los esqueletos carbonados provenientes de catabolismo de azucares (piruvato), ácidos grasos y aminoácidos deben ser degradados al grupo acetilo del acetilCoA (forma por la cual el ciclo de Krebs acepta la mayor parte de combustible aportado), a partir del complejo piruvato deshidrogenasa.

Complejo piruvato deshidrogenasa (membrana interna mitocondrial) Modo de accion: descarboxilación y deshidrogenación. Reacción global de la PDH: descarboxilación oxidativa irreversible (el piruvato pierde 1 C en forma de CO2 y los 2 C que quedan se transforman en el grupo acetilo del acetil-CoA, se obtiene 1 NADH el cual libera un ion hidruro el cual va a la cadena de transporte de e-)

Coenzimas, cofactores o grupos prostéticos del complejo: son 5 en total (4 de origen vitamínico). Origen Vitamínico: -Tiamina de pirofosfato (TPP) –Vitamina B1 (Tiamina), también es coenzima del piruvato descarboxilasa, la deficiencia de tiamina ocasiona el beberi (perdida de función neuronal) -Flavina adenina dinucleotido (FAD) – Vitamina B2 (Riboflavina). -Nicotidamina adenina dinucleotido (NAD)- Vitamina B3 (Nicotidamina).

-Coenzima A (CoA o CoA-SH) – Vitamina (B5 Pantotenato). Contiene un grupo tiol reactivo (SH) transportador de grupos acilo (los grupos acilo se unen covalentemente al grupo tiol formando tioesteres) *Tioesteres: elevado potencial de transferencia de grupos acilo (por eso se entiende que el grupo acilo unido a la coenzima A esta activado para su transferencia). Origen no vitamínico: -Lipoamida o lipoato: actúa como transportador de electrones y grupos acilo. Enzimas del complejo -Piruvato deshidrogenasa (E1): contiene en su sitio activo TPP unido a través del grupo difosfato el cual se une a un ion de magnesio coordinada por varios residuos de proteína. IMAGEN Cataliza: descarboxilación del piruvato produciendo hidroxietil-acetil- y a continuación la oxidación del hidroxietilo a grupo acetilo (reduciendo el enlace disulfuro del lipoato unido a E2, transfiriéndose el grupo acetilo en forma de enlace tioester con un grupo -SH del lipoato reducido). -Dihidrolipoamida acetil transferasa (E2): es el punto de conexión del lipoato unido a través de un enlace amida por el extremo N-terminal de un residuo de LYS. La unión de la lipoamida al extremo N de una lys da lugar a un brazo largo y flexible que puede desplazarse desde el sitio activo de E1 a los sitios activos de E2, y E3. Cataliza: transferencia del grupo acetilo al CoA (transesterificación), formando acetil-CoA. Es inhibida por los compuestos de arsénico orgánicos e inorgánicos. -Dihidrolipoamida acetil deshidrogenasa (E3): contiene en su sitio activo FAD y NAD. Cataliza: regeneración del lipoilo a su forma oxidada (forma disulfuro) transfiriendo sus electrones primero al FAD y luego al NAD. Proteínas reguladoras -Quinasas (PDK). -Fosfatasas (PDP). El complejo como tal se encuentra formado por: -60 subunidades E2 (forman el núcleo). -30 subunidades de E1 (hetero dímero). -6 subunidades de E3 (homodiméricas) -Es 5 veces mas grande que un ribosoma. Nota: La estructura básica E1-E2-E3 se utiliza en reacciones metabólicas similares como la oxidación el a-cetoglutarato (ciclo de Krebs), y la oxidación de a-cetoacidos. Proceso de descarboxilación oxidativa y deshidrogenacion del piruvato a acetil-CoA por el complejo PDH (mitocondria):

1.El piruvato reacciona con la TPP unido a E1 experimentando una descarboxilación hasta hidroxietilo, (el C-1 del piruvato se elimina en forma de CO2 y el C-2 que se encuentra en estado de oxidación correspondiente a un aldehído se una a TPP en forma de grupo hidroxietilo). Es el paso mas lento por lo que limita la velocidad de la reacción global, al igual que también es el punto en el cual el complejo ejerce la especificidad de sustrato. 2.Gracias a E1 se forma acetil tioester del grupo lipoilo reducido en E2, (el grupo hidroxietilo se oxida para dar lugar a un acido carboxílico acetato, los dos electrones eliminados de la oxidación reducen el enlace disulfuro de un grupo lipoilo en E2 para dar lugar a dos grupos tiol -SH. 3.Transesterificación en la que el grupo -SH del CoA sustituye el grupo -SH de E2 para obtener acetil-CoA en su forma completamente reducida (la porción acetilo producida en la reacción redox se esterifica en primer lugar con uno de los grupos tiol y luego se transesterifica con el CoA para dar el Acetil-CoA). Las reacciones 4 y 5 son transferencias electrónicas necesarias para la regeneración de la forma oxidada (disulfuro) del lipoilo de E2, preparando el complejo para otro ciclo. 4.E3 promueve la transferencia de dos átomos de hidrogeno de los grupos de lipoamida reducidos de E2 al grupo prostético FAD de E3 reduciéndolo a FADH2 y estableciendo la forma oxidada del grupo lipoamida-lisina de E2. 5.El FADH2 reducido de E3 transfiere un ion hidruro al NAD+ formando NADH. Recordar: -La secuencia de 5 reacciones es un ejemplo de la canalización de sustrato. -La reacción es irreversible debido a la formación del enlace tioester de alta energía del acetil-CoA. -Los intermedios permanecen unidos a la superficie de la enzima, sin necesidad de difundir fuera del complejo enzimático. -La ingesta habitual de grandes cantidades de alcohol produce acumulación de piruvato. Regulaciones del complejo Modificación alostérica: -NADH, acetil-CoA y ATP inhiben al complejo porque aumentan la PDHK. -NAD+, HA-CoA activan el complejo porque disminuyen la PDHK. -Relaciones elevadas de NADH/NAD+ y acetil-CoA/CoA disminuyen la velocidad de descarboxilación del piruvato. Modificación covalente: -El control por fosforilación y desfosforilación solo se da en eucariotas. -La fosforilación tiene lugar en un residuo de serina de la piruvato deshidrogenasa. -Los productos de reacción NADH y acetil-CoA activan la quinasa de la piruvato deshidrogena. -El aumento en la concentración de piruvato inhibe a la quinasa y al mismo tiempo la fosfatasa es activada por Ca++ y Mg++. Reacciones enzimáticas del ciclo (oxidación del acetil-CoA): Son 8 (la 1, 3, y 4 son irreversibles). 1. Condensación (irreversible). 2. Deshidrogenacion e hidratación .

3.Descarboxilacion oxidativa (irreversible) 4.Descarboxilacion oxidativa (irreversible). 5.Fosforilacion a nivel de sustrato. 6.Dehidrogenacion. 7.Hidratacion 8.Deshidratacio. 1.Condensacion aldolica + hidrolisis (formación del citratoirreversible): a partir de la condensación del acetil-CoA con oxalacetato para dar lugar a citrato, es catalizada por la citrato sintasa. El carbono metílico del grupo acetilo se une al grupo carbonílico (C-2) del oxalacetato y se forma de intermediario el citril-S-CoA el cual se hidroliza a citrato y coenzima A, durante la hidrolisis se produce una rotura del enlace tioester haciendo la reacción muy exergónica lo cual es esencial para el funcionamiento del ciclo por consecuencia de la muy baja concentración de oxalacetato. Entra H2O y sale Co-A (se recicla para ser usado en el complejo piruvato deshidrogenasa). Se da por un mecanismo de bisustrato ordenado: primero entra el oxalacetato produciendo un cambio conformacional cerrado para exponer la entrada del acetil-CoA.

2. Formación de isocitrato: la enzima aconitasa cataliza la isomerización reversible del citrato en isocitrato a través de la formación intermedia del ácido tricarboxílico cis-aconitato (compuesto que no se disocia de la enzima). -El citrato pierde 1 molécula de H2O dando lugar a un ácido intermediario de poca importancia, el cis-aconitato. El cis-aconitato reincorpora la molécula de H2O en una posición distinta a la original, dando lugar al isocitrato. -La aconitasa contiene un centro hierro-azufre que actúa en la fijación del sustrato en el sitio activo y en la adición o eliminación catalítica de agua, si hay carencia de hierro la aconitasa pierde su centro activo y adquiere otro papel. *Existe estereoespecificidad: El citrato se une asimétricamente a la aconitasa →Es proquiral. Las mitades pro-S y pro-R del citrato son imágenes especulares y no superponibles. Si la unión de la aconitasa al citrato es por la rama pro-R se da correctamente y la unión por la rama por-S no se da. -Es inhibida por el fluoroacetato (al metabolizarse en fluorocitrato)-

3.Oxidacion del isocitrato a a-cetoglutarato y CO2 (irreversible): la enzima isocitrato dishidrogenasa cataliza la descarboxilación oxidativa del isocitrato dando lugar a la formación de a-cetoglutarato produciendo las primeras moléculas de CO2 y NADH del ciclo. El centro activo contiene Mn+ que ayuda a la transferencia de e- al NADP+ y facilita la descarboxilación. La enzima existe en dos lugares distintos: en la mitocondria y citosol (dependiente del NADP), y en la matriz mitocondrial (dependiente de NAD, es la que actúa en el ciclo).

4.Oxidacion de a-cetoglutarato a succinil-CoA y CO2 (irreversible): la enzima a-cetoglutarato deshidrogenasa cataliza la descarboxilación oxidativa del a-cetoglutarato a succinil-CoA y CO2. El NAD+ actúa como aceptor de e- y el CoA como transportador del grupo succinilo. Se da la formación de un enlace tioester (reacción exergónica y irreversible). Recordar: La α-cetoglutarato deshidrogenasa es un complejo enzimático análogo a la piruvato deshidrogenasa. El mecanismo de reacción es el mismo, por lo que posee las mismas necesidades de coenzimas (TPP, NAD+, FAD, ácido lipoico y CoA-SH) 5.Conversion de succinil-CoA en succinato: es catalizada por la enzima succinil-CoA sintetasa, es una reacción conservadora de energía (presenta un paso intermedio en el que la enzima queda fosforilada en un residuo de histidina en el sitio activo), a partir de este grupo fosforilo se forma el GTP (se utiliza la energía del enlace tioester hidrolizado del succinil-CoA para generar GTP). Cuando hacemos el cálculo del balance este GTP se contabiliza como si fuera un ATP porque la nucleósido difósforo quinasa lo transforma en ATP (fosforilación a nivel de sustrato). Importante: diferencia entre sintasa y sintetasa (Ej: citrato sintasa y succinil-CoA sintetasa. La diferencia es sencilla: la sintetasa usa un nucleósido trifosfato de alta energía como el ATP o el GTP mientras que la sintasa no lo usa). 6. Oxidación de succinato a fumarato: es catalizada por la enzima flavo-proteica succinato deshidrogenasa. Grupos protéticos: FAD y centros Fe-S. El succinato se oxida (deshidrogena) entre los C2 y C3 a fumarato. Es inhibida por el malonato (inhibidor competitivo). Importante: la succinato deshidrogenasa es la unica enzima no soluble, ligada a la membrana (forma parte de la cadena respiratoria)

7. Hidratación de fumarato a malato: catalizada por la fumarasa, es una hidratación reversible en la que el fumarato pasa a L-malato, el estado intermediario es un carboanion. Importante: la enzima es altamente estéreo especifica: cataliza la hidrolisis del doble enlace trans del L-fumarato y no cataliza la del cis del malato – Ambos son isómeros – En la dirección inversa (D-malato a fumarato) la fumarasa es igualmente estereoespecifica no sirviendo el malato como sustrato. NUNCA se sintetiza el D-malato.

8. Oxidación del malato a oxalacetato: la L-malato deshidrogenasa unida al NAD catalizan la oxidación en el C2 del L-malato a grupo -C=O del oxalacetato. El equilibrio de la reacción está desplazada hacia la izquierda en condiciones termodinámicamente estándar, pero en las células el oxalacetato es eliminado continuamente por la reacción 1 (altamente exergónica de la citrato sintasa), lo cual mantiene la concentración de oxalacetato muy baja y la reacción se encuentra desplazada hacia la derecha.

Balance energético del ciclo:

Como viene del glucolisis y son 2 piruvatos se multiplica por 2. Resumen energético: entra un grupo acetilo (2C) combinándose con oxalacetato, salen 2 CO2 por la oxidación de isocitrato y a-cetoglutarato, Esta energía es conservada reduciendo tres NAD+, un FAD y la producción de un ATP o GTP. Al final del ciclo se regenera la molecula de oxalacetato. Importante: los dos átomos de C que salen en forma de CO2 no son los mismo que entraron en forma de acetilo ya que se necesitan 2 vueltas para que estos sean liberados. El ciclo genera directamente 1 ATP o GTP pero indirectamente 9 ATP (por cada piruvato) en la cadena de e-gracias a la formación de coenzimas reducidas.

Rendimiento energético del ciclo: Se conserva menos del 50% de la energía producida durante el ciclo debido a que la mayoría se libera en forma de calor, la variación de energía libre tiene lugar en dos procesos: -Combustión completa de los grupos acetilo: CH3-COOH + 2 O2 2 CO2 + 2H2O -209 Kcal/mol=874Kj/mol. -Hidrolisis del ATP: ATP + H2O ADP + PI -7 Kcal/mol = 30.5 Kj/mol. Los 10 moles de ATP producirán 70kcal luego del rendimiento (70 x 100/209 = 33.5%). Si se consideran 12.5 moles de ATP producidos liberaran 12.5 x 30.5 = 381.25 Kj/mol. Por lo tanto, el nuevo rendimiento es: 381.25 x 100 / 874 = 43,6 %. Marcaje de carbonos Se necesitan dos vueltas al ciclo para que los carbonos que entraron en el grupo acetilo del acetilCoA sean liberados. Si se marca el acetilCoA con C14 en los dos aromos de C del grupo acetilo y se sigue el curso de la radiactividad en las tres primeras vueltas al ciclo se puede observar: -El citrato permanecerá marcado la primera vuelta en dos carbonos 1(4) y 2(5). -Las moleculas de CO2 se desprenden en la segunda vuelta. -Puesto que el succinato muestra simetría el marcaje se distribuye 50% entre los 4 atomos de C del fumarato en la reacción de la succinato deshidrogenada en cada vuelta del ciclo.

Regulación del ciclo El Ciclo de Krebs estará regulado en base a sus 2 funciones (producción de energía y de metabolitos para otras vías), es decir, cuando haga falta energía o metabolitos se producirá. Puntos de regulación

Activador

Inhibidor

(Reacción y enzima)

Rx 1 citrato sintasa.

ADP

Rx 2 isocitrato deshidrogenasa.

Ca++ ADP (estimulación alostérica, aumenta afinidad de enzima al sustrato) Ca++

Rx 4 a-cetoglutarato deshidrogenasa

-NADH, succinil-CoA, ATP Citrato (compite con el oxalacetato por unirse al centro activo de la enzima) ATP

Succinil-coA y NADH

El calcio aparece en situaciones en las que el cuerpo necesita mas energía de la normal como por ejemplo en procesos como la contracción muscular, se produce la liberación de Ca2+, lo que contribuye a la activación del ciclo y posteriormente a la mayor síntesis de ATP.

En el control primario (respiratorio) el ciclo depende de: -Suministro de cofactores oxidados: NAD+,FAD. -Disponibilidad de:O2 -Acoplamiento con fosforilación: Disponibilidad de ADP . -Velocidad de utilización de ATP En el control secundario, los puntos se encuentran reguladas por tres factores: disponibilidad de sustrato, inhibición por productos acumulados y retro inhibición alostérica de las enzimas que catalizan las primeras etapas del ciclo. Disponibilidad de sustrato: disponibilidad de acetilCoA y oxalacetato (primer punto de regulación), los cuales regulan la citrato sintasa. Interviene la malato deshidrogenasa encargada de la disponibilidad de oxalacetato, la cual depende de la relación NADH/NAD+ (es decir, en una concentración alta de la relación NADH/NAD+ no se produce oxalacetato) Control alostérico: -el NADH y del ATP (moduladores alostéricos negativos) y el ADP y el Ca2+ (moduladores alostéricos positivos). -Inhibición de succinato deshidrogenasa por oxalacetato. Inhibición por productos acumulados: -El citrato inibe la citrato sintasa. -El succinilCoA inhibe a la a-cetoglutarato deshidrogenasa -Inhibición de succinato deshidrogenasa por oxalacetato. -Inhibición de citrato sintasa por ATP y acilCoA de cadena larga. -Activación alostérica de isocitrato deshidrogenasa por ADP y contrabalanceada por ATP y NADH

Naturaleza anfibólica (procesos anabólicos y catabólicos) del ciclo Los intermediarios del ciclo son utilizados en rutas biosintéticas.( ) Estos intermediarios pueden ser repuestos por otras vías ANAPLERÓTICAS .(

)

Rutas que generan compuestos intermediarios en el ciclo: -Degrdaciones de asp, phe y tyr dan fumarato. -Degradación de met, val y acidos grasos de numero impar de C dan succinilCoA.-Degradación de acidos grasos de numero par de C dan acetilCoA. Rutas que consumen intermediarios: -Obtención de glucosa por medio de la gluconeogénesis utiliza el malato transportado a través de la membrana interna mitocondrias. -Biosíntesis de acidos grasos y colesterol a partir del citrato. -Biosintesis de aminoácidos, nucleótidos y urea a partir de las interconversiones de a-cetoglutarato y oxalacetato junto con glutamato y aspartato. -Biosintesis de porfirinas utiliza como precursor succinilCoA.

Rutas anapleroticas Las rutas anapleroticas reponen a los intermediarios del ciclo que han salido para servir como precursores biosintéticos (oxalacetato y malato). Todas las rutas convierten el piruvato o fosfoenolpiruvato en oxalacetato o malato y todas tienen gasto de energía por la adición enzimática de un grupo carbonilo. La más importante en humanos es la carboxilación reversible del piruvato por el CO2 para formar oxalacetato catalizada por la piruvato carboxilasa. Piruvato carboxilasa: -Enzima reguladora inactiva en ausencia de acetilCoA (cuando hay acetilCoA en exceso se estimula la formación de oxalacetato para que el acetilCoA no se quede acumulado). -Dependiente de biotina.

Resumen...