Cinética enzimática - modelo Lineawer-Burk PDF

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Aula de Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Veterinária da UECE...

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Universidade Estadual do Ceará / Faculdade de Veterinária Bioquímica Veterinária I Prof. Dr. Genário Sobreira Santiago ----------------------------------------------------------------------------------------------------------

CINÉTICA ENZIMÁTICA: Lineweaver e Burk

Modelo

de

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INTRODUÇÃO Quando uma velocidade de reação, v0, é colocada em um gráfico contra a concentração do substrato [S], nem sempre é possível determinar quando a Vmax foi atingida, devido à lenta ascensão gradual da curva hiperbólica em concentração elevada de substrato. Porém, se 1/ v0 é colocada versus 1/[S], uma linha reta é obtida (figura 1). Esta curva é chamada de Lineweaver e Burk ou curva duplo recíproco e pode ser usada para calcular Km e Vmax, bem como para determinar o mecanismo de ação dos inibidores enzimáticos.

1 v máx

EQUAÇÃO DE LINEWEAVER e BURK Figura 1 Gráfico de Lineweaver e Burk

2

A equação de Michaelis e Menten

v0 =

v max [ S] (1) k m +[ S]

pode ser transformada algebricamente em outras formas que são muito úteis no tratamento gráfico dos dados experimentais. Uma transformação muito empregada é obtida de forma simples, invertendo-se ambos os lados da equação (1)

1 K m +[ S ] = V 0 V max [ S] Separando os componentes do numerador no lado direito da equação, obtemos:

Km [S] 1 = + V 0 V max [ S ] V max [ S ] Simplificando:

K 1 1 1 = m ∙ + (2) V 0 V max [ S ] V max

A equação (2) é uma transformação da equação de Michaelis-Menten chamada de equação de Lineweaver e Burke. As enzimas que obedecem exatamente a equação de Michaelis-Menten dão uma linha reta quando lançamos 1/ v0 versus 1/[S]. Esta linha tem

inclinação Km/Vmax; o intercepto no eixo 1/ v0 é igual a 1/Vmax e o intercepto no eixo 1/[S] é igual a -1/Km.

Exemplo 1 A velocidade de uma reação enzimática foi determinada em várias concentrações de substrato. Calcule Km e Vmax da reação.

[S](µM) 0,25

V0 (mM ∙ s−1 ¿ 0,75

0,5

1,20

3 1,0

1,71

2,0

2,18

4,0

2,53

1/[S](µM-1) 4,0

1/V0 (m M −1 ∙ s ¿ 1,33

2,0

0,83

1,0

0,58

0,5

0,46

0,25

0,40

Solução

1

Pela equação da curva (figura 2) temos

µM-1s . Como a inclinação da curva é

km v max

v max

≈ 0,34 , logo

segue-se que

km v max

v max ≈ 2,94 m M−1

=0,25 ∴ k m ≈ 0,74

1.4 f(x) = 0.25x + 0.33 R² = 1

1/V0(mM-1.s)

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

1/[S](μM-1

Figura 2

De maneira ideal, as condições experimentais são escolhidas de modo que as determinações da velocidade possam ser feitas para concentrações de substrato que sejam maiores e menores do que o Km. Isto origina valores mais exatos de

Km

e

4

V max . Um traçado de Lineweaver e Burk, se construído manualmente ou por computador, oferece a vantagem de que

Km

e

V max

podem ser rapidamente avaliados pelo olho.

Os traçados lineares são também mais convenientes do que as curvas para comparar múltiplos conjuntos de dados, como em diferentes preparações enzimáticas ou uma única enzima na presença de diferentes concentrações de um inibidor.

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA A atividade enzimática pode ser diminuída por grande número de substancias, genericamente chamadas de inibidores. Algumas destas substancias são constituintes normais das células, enquanto outras são estranhas aos organismos e sua presença acidental ou intencional – nas células provoca alterações significativas no metabolismo. Grande parte do arsenal farmacológico moderno é constituído por inibidores enzimáticos. É o caso das sulfonamidas (por exemplo, sulfanilamida) utilizada no combate a infecções bacterianas (quadro 1). Quadro 1. Inibidores competitivos de algumas enzimas, seus substratos e as moléstias naturais em cujo tratamento são empregadas. Inibidor Substrato Malonato, glutamato Succinato

Enzima Succinato

Moléstia -

Sulfanilamida 6-Mercaptopurina

desidrogenase Diidropteroato sintase Adenilosuccinato

Infecções bacterianas Leucemia

sintase Timidilato sintase Diidrofolato redutase DNA olimerase viral

Tumores Leucemia Aids

ρ -aminobenzoato Hipoxantina

5-Flurouracila Uracila Metotrexato Diidrofolato AZT Desoxitimidina Fonte: MARZOCCO & TORRES (2007)

A inibição por esses quimioterápicos se processa sobre uma particular enzima bacteriana, que não existe no organismo do hospedeiro. O bloqueio de uma única reação priva o organismo do produto daquela reação, que seria o substrato de uma reação subsequente. Assim, gradativamente, é afetado um conjunto de reações sequenciais, tornando a célula incapaz de reproduzir-se. Os inibidores atuam por meio de uma variedade de mecanismos. Alguns inibidores enzimáticos são substancias que se assemelham estruturalmente aos substratos dessas enzimas

5

Qualquer substância que possa diminuir a velocidade de uma reação catalisada por enzima é denominado inibidor. Os inibidores reversíveis ligam-se às enzimas através de ligações não covalentes. A diluição do complexo enzima-inibidor resulta na dissociação do inibidor reversivelmente ligado e recuperação da atividade enzimática. A inibição irreversível ocorre quando uma enzima inibida não retorna sua atividade após a diluição do complexo enzima-inibidor. Os dois tipos mais comumente encontrados de inibição são a competitiva e não competitiva.

Inibição competitiva Uma substancia que compete com o substrato normal pelo sítio de ligação de uma enzima é conhecido como inibidor competitivo. Esse inibidor normalmente é semelhante ao substrato, de modo que se liga especificamente ao sítio ativo, mas diferese do substrato por não reagirem com ele. A figura 2 mostra um traçado da velocidade de uma reação enzimática na presença de um inibidor em função da concentração de substrato. Como o inibidor impede algumas das moléculas do substrato de alcançar o sítio ativo, a

Km

parece aumentar (a afinidade da enzima pelo substrato parece

diminuir), mas como o inbidor se liga de modo reversível, ele constantemente se dissocia e se associa de novo a enzima, o que permite a molécula de substrato penetrar ocasionalmente no sítio ativo. Altas concentrações do substrato podem sobrepujar o efeito do inibidor, porque, quando

[ S ] ≫[ I ] a enzima é mais provável se ligar ao

substrato do que ao inibidor. A presença de um inibidor reversível não afeta a [S] tende a infinito, v 0

se aproxima do

k cat , de modo que quando

v max . A equação de Michaelis e Menten de

uma reação de modo competitivo tem a forma v0 =

v max [ S ] α k m +[S ]

Onde α é o fator que modifica

k m . O valor de

α

concentração do inibidor e da sua afinidade pela enzima: α=1+

[ I] ki

(grau de inibição) depende da

6

Onde k i

é a constante de inibição; ela é a constante de dissociação do complexo

enzima-inibidor (EI): k i=

[E][ I] [ EI ]

Quanto menor o valor de

k i , mas firmemente o inibidor se liga a enzima.

Exemplo 2. Uma enzima tem competitivo e k m de 12 μM

km

de

8 μM

na ausência de um inibidor

na presença do inibidor

3 μM . Calcule k i .

Solução O inibidor aumentou o

k m de um fator

é 1,5 vezes maior do que o valor de

α=1+

α . Como o valor de

k m sem o inibidor

km

com o inibidor

( 128 μMμM =1,5=α )

temos:

[I ] [ I] [ I] 3 μM 3 μM =6 μM ∴ =α−1∴ k i= = = α−1 1,5−1 0,5 ki ki

(a) Efeito sobre a V max O efeito de um inibidor competitivo é revertido aumentando-se [S]. Em uma concentração de substrato suficientemente elevada, a velocidade da reação atinge a V max

observada na ausência de inibidor (figura 3).

(b) Efeito sobre a K m Um inibidor competitivo aumenta a

K m aparente para um dado substrato. Isto

significa que, em presença de um inibidor competitivo, mais substrato é necessário para atingir a metade da

V max .

(c) Efeito sobre a curva de Lineweaver e Burk

7

A inibição competitiva mostra uma curva característica de Lineweaver-Burke, na qual as curvas das reações inibidas não inibidas apresentam intersecção sobre o eixo 1/ V0

em 1/ V max

( V max

não é alterada). As reações inibidas e não inibidas

atravessam o eixo 1/[S] em diferentes pontos, indicando que a

km

aparente está

aumentando em presença do inibidor competitivo.

Com inibidor

Sem inibidor

figura 3 Gráfico de Lineweaver e Burk para inibição competitiva

(d)Malonato como um exemplo de inibidor competitivo O exemplo clássico é a inibição competitiva da desidrogenase succínica pelo ânion malonato. A desidrogenase succínica é membro do grupo de enzimas que constituem o ciclo do ácido cítrico, a via final metabólica da degradação oxidativa de carboidratos e gorduras na mitocôndria. Esta enzima catalisa a remoção de dois átomos de hidrogênio do succinato, um de cada um dos grupos metilênicos (-CH2-). A desidrogenase succínica é inibida pelo malonato, o qual se assemelha ao succinato por ter dois grupos carboxila ionizados em pH 7,0, mas difere dele por apenas três átomos

8

de carbono. Desta forma o malonato não é oxidado pela desidrogenase succínica; ele simplesmente ocupa o sítio ativo, impedindo-o de atuar sobre o substrato normal. A reversibilidade da inibição por malonato é mostrada pelo fato de aumentos na concentração de succinato reduzirem a intensidade da inibição provocada por uma dada concentração de malonato. Outros compostos com distância apropriada entre dois grupos aniônicos podem agir como inibidores competitivos da desidrogenase succínica, entre estes estão oxaloacetato, um intermediário do ciclo do ácido cítrico. Destas relações estruturais conclui-se que a desidrogenase succínica tem dois grupos carregados positivamente, apropriadamente espaçados, capazes de atrair os dois grupos carboxila negativamente carregados do ânion succinato. O sítio catalítico da desidrogenase succínica mostra assim ser complementar à estrutura do seu substrato.

Exemplo 3 Recentemente foi descoberto que a esfingosina-1-fosfato (SSP) é importante para a sobrevivência da célula. A síntese da SSP a partir de esfiingosina e de ATP é catalisada pela enzima esfingosinaquinase. O conhecimento da cinética da reação da esfingosinaquinase pode ser importante para o desenvolvimento de drogas para o tratamento do câncer. A velocidade da reação da esfingosinaquinase, foi medida na presença e na ausência da threo-esfingosina, um estereoisômeros da esfingosina. Os resultados são mostrados no quadro abaixo Construa um gráfico de Lineweaver e Burk para responder as seguintes perguntas: (a) Quais são os valore de k m e v max ? (b) Que tipo de inibidor é a threo-esfingosina? Explique [Esfingosina](μM) 2,5 3,5 5 10 20 50

v 0 (mg. min−1 ) (Sem inidor) 32,3 40 50,8 72 87,7 115,4

v 0 (mg. min−1 ) (Com threo-esfingosina) 8,5 11,5 14,6 25,4 43,9 70,8

Solução (a) Inicialmente vamos fazer os cálculos separados na presença e na ausência do inibidor.

9 SEM INIBIDOR

COM INIBIDOR

1 [S ] 0,4000 0,285 0,200 0,100 0,050 0,020

1 v0

1 [S]

1 v0

0,031 0,025 0,019 0,013 0,011 0,008

0,4000 0,285 0,200 0,100 0,050 0,020

0,117 0,086 0,068 0,039 0,022 0,014

Sem Inibidor 0.04 v0(mg.min-1)

0.03

f(x) = 0.06x + 0.01 R² = 1

0.03 0.02 0.02 0.01 0.01 0 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.35

0.4

0.45

[S](μM)

Na ausência do inibidor temos (figura 4): 1 ≈ 0,008∴ v max ≈ 125 mg .min−1 v max km ≈ 0,058∴ k m ≈ 7,25 μM v max

Com Inibidor 0.14 V0(mM.min-1)

0.12

f(x) = 0.27x + 0.01 R² = 1

0.1 0.08

Figura 4

0.06 0.04 0.02 0 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

[S] (μM)

0.3

10

Figura 5

Na presença do inibidor temos (figura 5): 1 ≈ 0,01∴ v ≈ 100 mg. min−1 max v max km ≈ 0,2711∴ k m ≈ 27,11 μM v max O gráfico de Lineweaver e Burk é mostrado na figura abaixo (b) As retas nos gráficos de Lineweaver e Burk interceptam-se bem próximos ao eixo 1 v 0 . Portanto, threoesfingosina é muito provavelmente um inibidor competitivo. A inibição competitiva é também provável devido a similaridade estrutural entre o inibidor e o substrato, o que permite a competição pela ligação ao sítio ativo da enzima.

Figura 6

Inibição não competitiva Os inibidores pertencentes a esta classe não guardam qualquer semelhança estrutural com o substrato da reação que inibem. Seu efeito é provocado por ligação a radicais que não pertencem ao sítio ativo; esta ligação altera a estrutura enzimática a tal ponto que inviabiliza a catálise. O ponto de ligação de um inibidor não competitivo é a cadeia lateral de um aminoácido – o grupo OH da serina ou o grupo SH da cisteína, por exemplo. Como esses grupos são frequentes nas enzimas, a ação de inibidores não competitivos é bastante inespecífica, o mesmo inibidor podendo atuar em grande número de enzimas. Na inibição não competitiva o inibidor liga-se diretamente ao complexo enzima-substrato, mas não a enzima livre.

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Nesta reação, a etapa de ligação do inibidor tem a constante de dissociação:

k i'=

[ ES ] [ I ] [ ESI ]

O inibidor não competitivo, que não se assemelha ao substrato, provavelmente distorce o sítio ativo, fazendo com que a enzima seja cataliticamente inativa. Na presença de um inibidor não competitivo, tudo se passa como se efetivamente houvesse uma concentração menor de enzimas, e, uma vez que a velocidade da reação enzimática é diretamente proporcional à concentração de enzimas ativas, a velocidade da reação será menor do que na ausência do inibidor para qualquer concentração de substrato. Ainda mais, uma vez que o substrato e o inibidor não competitivo não competem pelo mesmo sítio de ligação, aumentos na concentração do substrato não podem anular ou mesmo atenuar o efeito do inibidor. A equação de Michelis e Menten passa a ser: v max [ S] v [I ] max 1+ [ S] α K = v0 = k m +[ S] k m +[S ] [ I] Onde α=1+ K A curva característica de Lineawer e Burk para a inibição não competitiva é mostrada na figura 8.

Com inibidor

Sem inibidor

figura 7 Gráfico de Lineweaver e Burk para inibição não competitiva

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(a) Efeito sobre a V max A inibição não competitiva não pode ser superada pelo aumento da concentração de substrato. Assim, inibidores não competitivos diminuem a (b)

V max da reação.

Efeito sobre a K m Os inibidores não competitivos não interferem com a ligação do substrato com a enzima.

Assim, a enzima mostra o mesmo

Km

na presença ou na ausência do inibidor não competitivo.

(c) Efeito sobre a curva de Lineweaver e Burk A inibição não-competitiva é facilmente diferenciada da competitiva pela curva 1/ V 0 versus 1/[S] e pela observação de que a V max

diminui na presença do inibidor, enquanto

Km

permanece inalterado.

d) Envenenamento por chumbo O chumbo forma ligações covalentes com as cadeias laterais sulfidrila da cisteína em proteínas. A ligação do metal pesado é irreversível e mostra inibição não competitiva. A ferroquelatase, uma enzima que catalisa a inserção de

2+¿ ¿ Fe

na protoporfirina, e a g-

aminolevulinato desidrogenase são exemplos de enzimas sensíveis à inibição pelo chumbo.

LEITURA “As enzimas podem ser cataliticamente defeituosas devido a mutações genéticas”

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São conhecidas muitas doenças genéticas humanas nas quais uma enzima é ou totalmente inativa ou apenas defeituosa em sua função catalítica ou regulatória. Em tais doenças a molécula da enzima defeituosa contém um ou mais resíduos de aminoácidos “errados” em sua(s) cadeia(s) polipeptídica(s) como resultado de uma mutação no DNA responsável pela sua codificação. A atividade catalítica de uma enzima depende não apenas da presença de resíduos de aminoácidos específicos nos sítios catalíticos e reguladores mas também de sua conformação tridimensional global. A troca de um único resíduo

BIBLIOGRAFIA CHAMPE, P. C., HARVEY, R. A. Bioquímica ilustrada. 2ª Ed. Porto Alegre: Artes médicas, 1996. CISTERNAS, J.R., VARGA, J., MONTE, O. Fundamentos de bioquímica experimental. São Paulo: Atheneu, 2001. 276p. LEHNINGER, A. Princípios de bioquímica. São Paulo: SARVIER, 1984. 725p. PRATT, C. W., CORNELY, K. Bioquímica essencial. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006, 716p.

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