Culture Cellulaire TP introduction PDF

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Introduction à la culture cellulaire in vitro, méthodologie, trypsine edta, cellules adhérentes...

Description

GBio1A – S2

Département Génie Biologique

TP INITIATION A LA CULTURE CELLULAIRE

U87 GFP

4h en binôme + organigramme ramassé au début de la séance + questions à rendre à la fin de la séance

Culture cellulaire et viabilité cellulaire I- BUT DE L’EXPERIENCE Il s’agit de se familiariser d'une part avec la manipulation des cellules eucaryotes IN VITRO dans des conditions d'aseptie et d'autre part avec le contrôle de la qualité d’une préparation cellulaire par une technique faisant appel au bleu Trypan.

II- MISE EN CULTURE DES CELLULES 1- LES CELLULES COS-7 Ces cellules proviennent de rein de singe. Dans certaines conditions de milieu, les cellules cos-7 sont capables de se multiplier indéfiniment in vitro. Elles peuvent toutefois entrer en quiescence dans des cas particuliers tels que la privation d’éléments nutritifs ou la surpopulation. Ces cellules sont dites adhérentes car elles s’accrochent au plastique des récipients de culture

(flasque ou

boîtes),

via

des

protéines

présentes

à

la

surface

cellulaire (intégrines). Il est par conséquent important de vérifier la confluence

de

ces

cellules

pour

éviter,

comme

précédemment

cité,

une

surpopulation, car celle-ci engendre une forte mortalité liée au phénomène appelé « inhibition de contact ». Afin de pouvoir détacher des cellules adhérentes de leur support de culture, on utilise très souvent une protéase, appelée Trypsine, qui va, en coupant les protéines présentes sur la surface de la cellule, rompre le contact entre cellule et support, et entre cellules. Différentes précautions doivent être prises lorsque l’on utilise la trypsine : -

On doit tout d’abord éliminer les protéines du milieu de culture (lavage des cellules en tampon phosphate) qui empêcheraient la trypsine de fonctionner (saturation de l’enzyme par quantité trop importante de substrats potentiels) ainsi que les ions Ca2+ (interviennent dans les liaisons intercellulaires)

-

On ne doit pas prolonger trop longtemps le traitement afin d’éviter d’endommager les membranes cellulaires

-

On doit vérifier au préalable qu’un traitement à la trypsine n’est pas inadapté à l’usage que l’on souhaite faire des cellules par la suite (par exemple si on veut réaliser un marquage mettant en évidence une protéine de surface, on ne peut pas utiliser la trypsine qui cliverait également la protéine d’intérêt)

Pour arrêter l’action de la trypsine, on peut utiliser différentes méthodes, dont la très forte dilution, la plus « simple » étant d’ajouter une forte

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quantité de protéines (par exemple par ajout de milieu de culture) afin de saturer l’enzyme et d’arrêter son activité. RECOMMANDATIONS Pour éviter toute contamination bactérienne ou autre, il est recommandé de suivre les consignes suivantes: 1) Toutes les manipulations portant sur le matériel biologique doivent être réalisées sous la hotte à flux laminaire (ou PSM poste de sécurité microbiologique). 2) Le plan de travail de la hotte à flux laminaire doit être gardé le plus propre possible en le désinfectant à l’aide d’éthanol 70%. 3) Le matériel et les solutions doivent être stériles. 4) Eviter de parler pendant la manipulation.

2- MILIEU DE CULTURE * Définition et propriétés : C’est

un

milieu

qui,

par

sa

composition,

apporte

les

principaux

constituants du milieu dans lequel les cellules se trouvent à l’état naturel. Il doit de ce fait contenir les éléments nutritifs nécessaires et répondre aux exigences des cellules du point de vue physicochimique (pH, osmolarité, etc…). Les milieux de culture employés sont variables en fonction des types cellulaires mais contiennent d’une manière générale les mêmes catégories d’éléments (acides aminés, sucres, sels, vitamines, facteurs de croissance…). Le milieu de base (type DMEM), est l’un de ces milieux, disponibles chez les fournisseurs des laboratoires, qui assurent la survie des cellules in vitro. Toutefois, cellulaires

la

prolifération

nécessitent

et

l’ajout

l’expression d’un

de

certain

différentes nombre

de

fonctions composés

complémentaires. Ces composés doivent être ajoutés extemporanément car ils ne restent pas stables une fois dilués dans le milieu de culture et conservés à 4°C. Une fois complémenté avec toutes les substances nécessaires pour les cellules à maintenir en culture (sérum de veau fœtal, acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium) plus des antibiotiques permettant de limiter les risques de

prolifération

bactérienne

(on

peut

également

ajouter

des

substances

antifongiques pour limiter les risques de contamination par des champignons microscopiques), le milieu est souvent noté +/+, ce qui par convention, signifie que le milieu est prêt à l’emploi.

III- TESTS DE VIABILITE Quand les cellules sont fraîchement isolées à partir d’un tissu, la proportion de cellules vivantes doit être déterminée avant leur utilisation. La viabilité cellulaire est souvent déterminée par mesure de

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l’intégrité de la membrane plasmique. Plusieurs techniques sont utilisées pour mesurer la viabilité cellulaire. Parmi celles-ci: - Le comptage des cellules marquées par un colorant pour lequel la cellule est normalement imperméable. - Le comptage des cellules fluorescentes après coloration par des marqueurs

de

la

viabilité

ou

de

la

mortalité

cellulaire

(cette

2ème

manipulation ne sera pas réalisée au cours du TP).

* Principe de la mesure par le bleu Trypan Mis en contact avec une suspension cellulaire, le bleu Trypan va pénétrer

dans

toutes

les

cellules.

Les

cellules

vivantes

vont

pouvoir

l’exclure de leur cytoplasme par un mécanisme nécessitant de l’énergie. En revanche, les cellules mortes ou mourantes ne possèdent plus l’énergie nécessaire pour cette exclusion et vont conserver le colorant dans leur cytoplasme. Ainsi, observées au microscope optique, les cellules vivantes n’auront

pas

de

coloration

alors

que

les

cellules

mortes

et

mourantes

apparaissent colorées en bleu foncé. Du fait de son action tératogène, le bleu Trypan est dangereux pour l'utilisateur (voir fiche de sécurité). Il est également cytotoxique et finira par colorer la totalité de la population cellulaire après un délai variable en fonction de la lignée considérée.

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IV- MANIPULATION : REPIQUAGE DE CELLULES ATTENTION, toutes les opérations s'effectuent sous la hotte de façon stérile et chaque étape nécessite un contrôle microscopique. 1) Observer au microscope le flacon de culture qui vous a été attribué. 2) Identifier par le nom des manipulateurs ce flacon de culture et en retirer et jeter son milieu de culture. 3) Mettre 5 mL de PBS dans le flacon de culture pour bien recouvrir les cellules et les laver (incliner le flacon pour bien faire couler le PBS sur les cellules). 4) Retirer tout le PBS avec la même pipette et le jeter. 5) Mettre 1 mL de trypsine dans le flacon et incuber à 37°C (incubateur) pendant quelques minutes. 6) Identifier un tube Eppendorf dans lequel vous délivrez 400 µL de solution de bleu Trypan (prête à l’emploi). 7) Nettoyer et préparer la cellule de Malassez et la lamelle. 8) Vérifier, sous le microscope inversé que les cellules du flacon soient décollées (cellules rondes en suspension dans la trypsine). 9) Si les cellules sont bien décollées, ajouter dans le flacon 3 mL de DMEM +/+ (le sérum contenu dans le milieu inhibe l’action de la trypsine), sinon continuer l’incubation quelques min supplémentaires. 10) Aspirer et refouler doucement la suspension cellulaire (veiller à ne pas « noyer » le pipet-aid) puis récupérer la totalité de la suspension cellulaire dans un tube 15 mL et en prélever 100 µL. 11) Ajouter ces 100 µL aux 400 µL de bleu Trypan dans le tube Eppendorf, homogénéiser doucement en aspirant et refoulant puis déposer une faction de la suspension cellulaire sur la cellule de Malassez. 12) Laisser sédimenter 1 à 2 minutes. 13) Ajouter dans le même flacon de 25 cm2 6 mL de DMEM +/+. 14) Compter au microscope les cellules déposées sur la cellule de Malassez puis calculer le nombre de cellules/mL de la suspension étudiée en distinguant cellules vivantes et cellules mortes. 15) On veut ensemencer 4.105 cellules vivantes dans un flacon de 25 cm2. Calculer

le

volume

de

suspension

cellulaire

à

ajouter

dans

le

flacon

précédemment préparé avec du DMEM+/+. 16) Bien homogénéiser et laisser incuber à l’étuve à 37°C, 5% CO 2. 17) Observer vos flasques à 24 heures et à 48h.

V- PREPARATION DU TP Chaque binôme réalisera en amont un PETIT travail pour préparer le TP (1 feuille RV soit 2 pages maximum) dans lequel seront exposés les points suivants : •

Principe/Glossaire des produits utilisés

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•

Compréhension de la méthode de comptage : cellules vivantes et cellules mortes (coloration au bleu Trypan) et % de mortalité

•

Compréhension de la méthode de calculs pour réaliser l’ensemencement du nombre de cellules demandées et calcul de la densité cellulaire obtenue (nombre de cellules par mL dans le flacon préparé)

+ RENDRE une feuille de travail notée avec dessin/organigramme du déroulé des manipulations (à préparer en amont pour le jour du TP – l’accès à la salle sera refusé si ce travail n’est pas réalisé)

Exemple :

Tube eppendorf

Falcon

Flasque T25

NB : ce TP3 sera noté dans le cadre des enseignements pratiques du module M23I02. La note tiendra compte du travail demandé en amont, de la manipulation en elle-même, de la qualité obtenue (suivi des cellules après 24 et 48h d’incubation) et du compte rendu (format distribué le jour du TP).

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Lamelle

Quadrillages

Suspension

Lame

butées = 1 µl 10 carreaux

carreau carreau

10 carreaux

carreau

carreau

100 carreaux = 1 mm3 = 10-3 ml = 1 µl 1 carreau = 20 carrés = 0,2 (l) x 0,2 (L) x 0,25 (e) = 0,01 mm3 = 10-5 ml = 0,01 µl 1 carré = 5.10-7 ml Fig.1 Cellule ou Hématimètre de Malassez. Concentration cellulaire : N x 1000 x d = nombre de cellules/ml N : nombre de cellules sur toute la lame (100 carreaux) - x 1000 : nombre de cellules pour 1 ml d : facteur si dilution (bleu Trypan, suspension cellulaire, …) -

-

Taux de mortalité : % de cellules colorées par le bleu Trypan

Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles

du

quadrillage.

Votre

nombre

final

(N)

de

cellules

doit

correspondre à 100 rectangles (par exemple si vous trouvez n cellules dans 20 rectangles, vous devez rapporter ce nombre à 100 rectangles, soit (N = n x 5). N’oubliez pas votre facteur de dilution.

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Initiation à la culture cellulaire eucaryote 1- Milieu de culture La culture de cellules eucaryotes animales est différente de celle des cellules procaryotes plus autonomes. Les cellules procaryotes ont besoin de : - sels minéraux - extrait protéique (extrait de levure, peptone = viande digérée par des enzymes pancréatiques - sucres. Les cellules eucaryotes ont des besoins diversifiés, les synthèses sont incomplètes, elles ont donc besoin de précurseurs. Milieu synthétique complexe quaternaire : - a.a. essentiels (glutamine "extemporanément" à 1 mois) - sels minéraux - pyruvate de sodium - vitamines. a.a. essentiels besoin en a.a. pour les cellules dans l'organisme et en culture

a.a. synthétisés par des cellules spécialisées dans l'organisme donc à rajouter en culture

a.a. synthétisés par les cellules dans l'organisme et en culture

Arginine

glutamine

glycine

Histidine

cystéine

alanine

Isoleucine

tyrosine

serine

Leucine

asparagine

Lysine

acide aspartique

Méthionine

acide glutamique

Phénylalanine

proline

Thréonine Tryptophane Valine

Les cellules en culture peuvent synthétiser les précurseurs des acides nucléiques à partir des simples composants du milieu. Les vitamines sont fragiles, elles ne résistent pas à l'autoclave. Contrairement au milieu bactérien que l'on peut autoclaver, ces milieux seront filtrés. On dispose de filtre de nitrocellulose stérilisé aux rayons γ dont les tailles sont de 0,45 μm ou 0,22 μm mais qui n'arrêtent pas, ni les virus, ni les mycoplasmes. On peut arrêter les mycoplasmes avec des filtres de 0,1 μm.

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On complète le milieu synthétique avec : - des protéines sériques en ajoutant du sérum animal (partie acellulaire du sang). Il en existe de différentes qualités : cheval (pauvre), lapin, bœuf et veau (riche). Le sérum fœtal de veau (FCS = fœtal calf sérum ou SVF = sérum de veau fœtal) que l'on utilise apporte de l'albumine, de la transferrine (action sur l'activité mitotique) et des hormones stéroïdes (œstrogènes) impliqués aussi dans la division cellulaire donc des facteurs de croissance. - des antibiotiques : pénicilline et streptomycine. Stérilité On travaille dans des conditions très strictes de stérilité car la vitesse de pousse est lente. Une mitose prend entre 18 et 36 h, alors que le temps de génération des bactéries est de 20 min. Elles peuvent rapidement envahir la culture. Une cellule animale est 1000 fois plus grande qu'une bactérie et 10 fois plus grande qu'une levure. Température La permissivité est faible, entre 37 et 40°C. Certaines réactions métaboliques ne se font plus en dessous de 37°C, ou trop vite audessus. Humidité Hydratation permanente, 100 % d'humidité. À 37°C tout sèche : l'évaporation du milieu entraîne la concentration des sels puis la plasmolyse des cellules. L’ambiance humide de l’incubateur est propice aux contaminations. L’utilisation de fongicides (par exemple le sulfate de cuivre) et/ou de bactéricides dans le réservoir d’eau est conseillée. Équilibre acido-basique En présence de CO2, L'équilibre acido-basique des cellules est réalisé par un tampon carbonate - bicarbonate. Il permet de pomper le CO2 et acidifie le milieu suivant la réaction suivante : CO2 + H2O donne HCO3- (ion bicarbonate) + H+ Le CO2, présent en volume prédéterminé (5%), se dissout dans le milieu de culture tamponné au bicarbonate et prévient ainsi son alcalinisation spontanée, toxique pour les cellules. Le CO2 en excès pousse la réaction vers la formation de protons qui diminuent progressivement le pH du milieu jusqu'à l'équilibre (pH 7,2 à 7,4). Le milieu contient un indicateur coloré, le milieu est rose. Lorsque la culture a beaucoup poussé, le milieu va pomper le CO2 qui provient de la dégradation des sucres et donc s'acidifie, il devient jaune.

2- Études des cellules adhérentes et non adhérentes Les 1ères cellules cultivées sont les cellules HeLa en 1952 qui provenait d'un cancer de l'utérus (Henrietta Lacks). On sait donc

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cultiver des cellules cancéreuses, ou cellules transformées, qui sont immortelles, mais aussi maintenant des cellules normales en supplémentant les milieux de culture, on parle de culture cellulaire primaire, on peut obtenir dans ce cas un maximum de 50 à 100 générations. Les cellules différenciées, en culture, peuvent continuer certaines de leurs fonctions : - des myoblastes (cellules précurseurs des muscles) sont capables de fusionner pour former les cellules musculaires multinucléées, - les globules rouges continue à produire de l'hémoglobine. Cellules non adhérentes Elles proviennent de tissu non organisé comme le sang (tissu hématopoïétique). Ce sont des cellules libres. On va travailler avec des lignées lymphoblastoides (cellules du sang ou de la moelle osseuse). On dérive des lignées cellulaires à partir des cellules du sang d'un malade atteint d'une leucémie par exemple. Cellules adhérentes Ce sont des cellules issues de tissu organisé. Pour détacher les cellules, on utilise une solution qui contient : - un agent chélateur des ions divalents EDTA ou EGTA qui va rompre les liaisons Ca2+ et Mg2+ dépendantes au niveau des interactions cellules-cellule et cellule-substrat, - de la trypsine, une protéase douce qui va digérer les adhérences, rendre la membrane cellulaire glabre. Les cellules vont passer d'un aspect étoilé à un aspect rond comme les cellules non adhérentes, et cet état est réversible. La première étape consiste à éliminer, en pompant, le milieu de culture. On l’enlève car il est riche en protéines (10 mg/mL), il détournerait l'action de la trypsine. Après action de la solution de trypsine/EDTA, on stoppe la réaction en rajoutant le milieu de culture pour la diluer et détourner son action sur les protéines du sérum. Porter les flacons inclinés pour ne pas laisser sécher les cellules, elles éclateraient. L'adhérence des cellules au substrat provient de l'interaction entre la fibronectine qui a une forme en V et le plastique. Les cellules émettent des prolongements cytoplasmiques dont la rigidité est assurée par des filaments d'actine accrochés par l'intermédiaire de la vinculine à la membrane et plus spécialement aux récepteurs de la fibronectine (protéine de 140 kDa de la famille des intégrines).

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