Résumé des vidéos TP Biologie Cellulaire PDF

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Summary

Je vous laisse un petit résumé et les points importants à suivre pendant le TP. Les informations ont été extraites des vidéos téléchargées sur Claroline...

Description

TP BIOLOGIE CELLULAIRE Résume et points importants sur les vidéos

1er Vidéo : Pièce de Culture Cellulaire/Quels en sont les équipements ? -

Microscope à objectif inversé à contraste de phase : Le contraste de phase va permettre d’observer les cellules foncées dans un fond claire et les objectifs seront inversés (par dessous) qui vont permettre d’observer les cellules qui sont collées dans le fond de la boîte.

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Hotte à flux laminaire vertical : L’aire est filtrée et va arriver de manière stérile du haut vers le bas, les grilles qui sont devant et derrière van à faire le recyclage de l’aire qui va remonter et être filtré à nouveau. A l’intérieur de la hotte on aura un flux d’aire stérile en permanence. Pas travailler sur le griller sinon sur la partie plaine qui est la plus stérile.

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Incubateur : Avec les paramètres marqués sur la porte, température à 37° et 5% de CO2. A l’intérieur un petit plateaux lamineux remplie d’eau qui permet limiter l’évaporation du milieu du culture. Porte maximum de temps fermé pour éviter la fuite de CO2.

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Equipements classiques : Centrifugeuse, bain marie à 37° (pour chauffer le milieu culture avant les expériences).

2ème Vidéo : Observation des cellules à confluence Avant toute expérience on doit visualiser les cellules au microscope. Microscope inversé à contraste de phase pas d’oculaire mais avec un écran. - Cellules : Un peu difficile de voir parfois, des cellules très serrées les uns contre les autres elles ont atteint un niveau de confluence → des cellules confluentes. - Cellules foncées : Des prolongements cellulaires. On peut repérer surtout les noyaux (sphères claires) et à l’intérieur on peut observer 2-3 sphères très sombres qui sont les nucléoles. - La majorité des cellules sont très étales on les voir très sombres et on à du mal à distinguer les unes avec les autres. - Cellules claires : Des cellules très rondes et très réfrangeant. Cellules qui ont perdues leur étalement et qui sont devenues rondes et le but de ces cellules et de réaliser une division cellulaire, alors, pour pouvoir ce division cellulaire les cellules perds sont étalement (se décroche) devienne sphérique gagne un espace en 3 dimensions (réfrangeant à la lumière). Après division les cellules devront se rétaler sur la boîte mais étant donné qu’il n’y a plus de place sur la boîte ces cellules vont finir par mourir. Si on agiter la boîte il y a des cellules qui bougent qui ont tenté de se diviser et qui non pas réussir à se rétaler. Quand on à des cellules très confluentes on doit s’en occuper sinon elles finiront par mourir. → Trypsiner les cellules pour les détacher du support réensemencer dans une autre boîte pour les laisser de la place pour pouvoir proliférer.

3ème Vidéo : Trypsination des cellules TRYPSINATION - Enlever le milieu - 2 lavages PBS (5-10mL) Important pour pouvoir enlever tout l’excédent du milieu culture (Il y a de sérum de veau fœtal avec des facteur de croissance qui sont des protéines qui peuvent être digérer para la Tryp et elle ne pourras pas alors décoller les cellules de leur support). - Enlever PBS - 2mL de Trypsine/EDTA (TE) Va enlever le contact support-cellule, le EDTA est un agent chélate du calcium étant important pour les jonctions cellulaires. - Incuber 3 à 5 min à 37°C - Vérifier la re-suspension, grâce à une observation au microscope. - Ajouter 8mL de milieu complet sur les 2mL de Trypsine, le but c’est d’inhiber la Tryp, car si elle agit beaucoup de temps peut abimer les cellules. ➔ 10mL suspension cellulaire dans un flacon 15mL, On va obtenir des cellules en culture (susp cellulaire) pour l’étape suivante. Cellules décollées qui bougent, elles sont bien en re-suspension. Au fond de la boîte il y a des cellules encore adhérentes mais toutes les cellules sont rondes → cellules pas étalées On peut aider à les détaler en tapotant légèrement la boîte.

4ème Vidéo : Le comptage des cellules sur une cellule de Malassez COMPTAGE CELLULAIRE - Re-suspendre les cellules dans le flacon - Prélever 100microL de suspension cellulaire et les mettre dans un eppendorf. - Ajouter 10microL de bleu Trypan, va colorer les cellules mortes en bleu. On va alors compter les cellules que sont blanches pas les bleues. - Bien mélanger - Prélever 15microL et les introduire sur une cellule de Malassez - Procéder au comptage Cellule de Malassez : 100 petits carreaux, 10 carreaux en vertical et 10 à l’horizontal. Les carreaux peuvent être conformés par des lignes verticales, horizontales, mixtes ou sans lignes. → Nombre des cellules/microL.

Déposer délicatement les 15microL sur la grille de comptage entre la lame et la lamelle.

Attention à ne pas compter une même cellule 2 fois, pour éviter cela on doit compter soit tout en haut à droite, soit toute en bas à gauche.

5ème Vidéo : Calcul du volumen de suspension cellulaire à déposer par boîte On peut compter seulement 3 lignes, celui en première puis en milieu et en fin la dernière ligne, on somme et on fait une moyenne. - Exemple : 55, 57, 53 → moyenne 55 cellules/ligne - Dans 1 ligne il y a 10 carreaux → alors 55 cellules/10 carreaux - Comme il y a 100 carreaux dans toute la cellule de Malassez → 550 cellules/100 carreaux - Les 100 carreaux représentent 1microL → 550 cellules/microL Alors on a 550 cellules par microL. - On veut ensemencer 150 000 cellules/boîte - On va utiliser des boîtes de 35mm dont la contenant total du milieu est de 2mL - Quel est le volumen à prélever dans ma suspension cellulaire ? 550 cellules ---------- 1microL 150 000 cellules -------- ?

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150 000/550 = 273 microL

273 microL cellules + 1,727mL du milieu de culture (pour faire les 2mL de la boîte) Mais on va rensemencer 10 boîtes et pour cela on doit faire un mélange (un mix), c’est-à-dire 10 fois plus des cellules et 10 fois plus du milieu culture → 2,73 mL des cellules + 17,27 mL du milieu de culture (un mélange de 20mL au total pour distribuer alors 2mL dans chaque boîte)

6ème Vidéo : Entretien des cellules « passage au 10ème » Avec les cellules qui restent dans des boîtes de 100mm. - Dans chaque boîte on peut y avoir en contenant de 10mL → dilution en 10ème → 1mL des cellules et 9mL du milieu....