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DNA Polimerasa III...

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DNA Polimerasa III Es la encargada de elongar la molécula de DNA naciente. Es mucho más compleja que la DNA polimerasa I. Se trata de una proteína multimérica con 10 tipos de subunidades diferentes (no hace falta saber todos los nombres de cada unidad). -

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Subunidades α y ε: contienen las actividades polimerasa y exonucleasa, respectivamente. Asociadas a la subunidad θ forman la polimerasa núcleo (165.000 Da). Subunidades τ, γ, δ, δ, χ, ψ: constituyen el complejo de carga de la abrazadera. Este complejo se une a 2 polimerasas núcleo a través de 2 subunidades τ para formar la DNA polimerasa III * (750.000Da). Las subunidades γ, δ, δ cargan las subunidades β entrantes y abren el anillo (gasto de ATP) para que se acomode en su interior la hebra conductora y la hebra rezagada en cada fragmento de Okazaki. Subunidades β: constituyen la abrazadera del DNA para obtener una procesividad mayor. Se asocian 2 subunidades β con cada polimerasa núcleo. La DNA polimerasa III * unida a 4 subunidades β constituyen el holoenzima de la DNA polimerasa III (900.000 Da).

Lo más importante es que está formada por dos grandes núcleos (laterales, compuestos por 3 subunidades, una grande y 2 pequeñas) los cuáles van a ser los responsables de albergar las dos actividades más relevantes de la replicación: polimerasa y exonucleasa 3’-5’. Cada uno de los núcleos se va a encargar de replicar una hebra. Las subunidades centrales, son las que van a producir la interacción entre los dos núcleos y van a colaborar a que toda la macroestructura se quede

interaccionando con las dos cadenas del DNA para que se pueda replicar. Este conjunto se llama complejo de carga de la abrazadera. Las subunidades que aparecen sobre los núcleos (lila, blanco) son las abrazaderas de la DNA polimerasa, que va a ser la responsable de la procesividad de la enzima. Por lo tanto, bajo la dirección de una única unidad proteica se produce la síntesis simultánea de dos hebras, una de forma continua, en una dirección y otra retrasada en fragmentos de Okazaki, en dirección contraria.

El replisoma: proteínas de replicación Pero las DNA polimerasas no son suficientes por si solas para llevar a cabo la replicación. La replicación en E. coli requiere más de 20 factores proteicos diferentes, cada uno con una tarea específica. Son un conjunto de moléculas proteicas, que se van a situar en la horquilla de replicación cuando se abre la doble hebra de DNA y forman el replisoma o sistema de la DNA replicasa.

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Helicasas (DnaB): se trasladan a lo largo del DNA y separan las 2 cadenas de DNA utilizando la energía química del ATP para que las hebras molde sean accesibles a la polimerasa. Son las que aparecen en primer lugar, son las primeras proteínas en intervenir, tienen que identificar el lugar en el que tiene que comenzar la replicación y abrir las hebras. Abren la doble hebra justo en el origen de replicación. (en diapo, en rojo la actividad y entre paréntesis en azul el nombre). La helicasa que funciona en procariotas es la DNA B.

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Topoisomerasas: (Dna girasa): relajan la tensión topológica de la estructura helicoidal del DNA que aparece por delante de la horquilla, causada por la separación de las 2 hebras. Una vez abierto el origen de replicación, como consecuencia de esa apertura, se forman una serie de tensiones justo al lado de la zona de abertura, ya que esa zona se superenrolla. En este caso intervienen las topoisomerasas, que compensan esos giros, para compensar las tensiones que se estan introduciendo en la molécula. Se colocan por lo tanto por delante de las helicasas. En el caso de E. coli estas topoisomerasas son las DNA girasas. Proteínas de unión al DNA (SSB): unión cooperativa al DNA de cadena sencilla. Estabilizan las hebras de DNA impidiendo su renaturalizacion y el apareamiento de bases dentro de la misma cadena. La naturaleza del DNA es estar en forma de doble hebra. Por lo tanto, tiende rápidamente a volver a formar el apareamiento de las bases para volver a su estructura. Por eso aparecen en escena proteínas estabilizadoras de la hebra sencilla o proteínas de unión del DNA, o SSB. Lo que hacen es que rápidamente reconocen que hay ADN de hebra sencilla, se colocan en el complejo y estabilizan la hebra sencilla del DNA hasta que termina la replicación. Primasas (Dna G): son RNA polimerasas especializadas que sintetizan los RNA cebadores que tienenque estar unidos al DNA antes de que la polimerasa comience la síntesis. En este momento aparece el cebador: sintetizado por enzimas de RNA polimerasa llamadas primasas. En E. coli esta primasa se llama DNA G. se sintetizan dos cebadores: o Uno para continuar la síntesis de la cadena continua. En esta cadena solo es necesario sintetizar un cebador. o Otro para sintetizar el primer fragmento de Okazaki. En este caso, se sintetiza un cebador para cada fragmento. En este momento empieza a funcionar la DNA polimerasa III. La DNA polimerasa I degradará los cebadores de RNA (actividad exonucleasa 5’3’) y los reemplaza por DNA. DNA ligasa: sellan la mella (enlace fosfodiéster roto) que deja la DNA polimerasa I después de eliminar el cebador. Interviene en último lugar uniendo los fragmentos.

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Proceso de replicación

La síntesis de una molécula de DNA se puede dividir en tres etapas: inicio, elongación y terminación. 1. Iniciación de la replicación Implica el reconocimiento del origen de replicación. En el DNA circular, se define una zona como origen de replicación. En E. coli este origen de replicación se llama ori C y está formado por 245 pares de bases que contienen secuencias muy conservadas con respecto al resto de procariotas. Pero el punto más importante son dos regiones en estos 245 pares de bases:

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Uno situado hacia el extremo 5’: hay una región formada por 3 repeticiones en tándem (seguidas) de una secuencia bastante conservada a lo largo de la evolución formada por 13 pares de bases, con contenido mayoritario altamente rico en pares AT. Esto significa que tiene más regiones con doble enlace que con triples, siendo regiones más fáciles de separar que las de pares GC, unidas por triple enlace. Otro, con secuencias caracterizadas por su repetición en las pares de bases. En este caso son 4 secuencias, pero no en tándem, sino dispersas a lo largo del resto del cromosoma. (ver esquema). Estas secuencias también son ricas en pares AT. Formadas por 9 pares de bases, cada una.

El proceso comienza con la apertura de la doble hélice en el origen de replicación y síntesis de los RNA cebadores para proceder a la polimerización del nuevo DNA. El truco de cómo se produce la abertura en el sitio de replicación estriba aquí. La enzima que vaya a abrir la doble hebra, lo primero que va a hacer es captar estas señales que marcan en el genoma el punto de inicio. Pero NO es la helicasa la que interviene directamente, sino que hay una serie de proteínas necesarias para que se produzca ese reconocimiento y ayudan a la helicasa a abrir la cadena. Participan 9 proteínas diferentes: DnaA, HU, DnaB (helicasa), DnaC, SSB, DNA girasa (topoisomerasa) DnaG (primasa), Dam metilasa y RNA polimerasa. Todavía hay discusión de cómo se produce exactamente la interacción entre la primera molécula que hace su aparición y el origen de replicación. Lo que está claro es que la intervención se produce antes de que las 2 helicasas formen las dos horquillas de replicación. -

Lo primero que aparece es una proteína, la DNA A, formada por 8-20 moléculas, capaces de interaccionar con las estructuras de reconocimiento de la región derecha de la molécula de DNA, las 4 repeticiones de 9 pb que no están en tándem. El complejo reconoce la región de 3 repeticiones de 13 pb y desnaturaliza el DNA en esa zona. Este proceso requiere a la proteína HU y ATP.

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Aparece en escena otra proteína, tipo histona, la HU, que aparecía cuando vimos como se enrollaba

el DNA en procariota. En colaboración con estas proteínas que reconocen el origen de

replicación, favorece que la molécula de DNA se envuelva alrededor de esa estructura parecida a una estructura globular y como consecuencia de ese enrollamiento se acercan las regiones ricas en AT y gracias a un proceso de aportación de ATP, estas regiones se empiezan a abrir. Las zonas que se enrollan alrededor de la HU son las 4 -

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regiones que no están en tándem. Pero la apertura se produce en las 3 regiones en tándem, como consecuencia de que este enrollamiento tira de una de las hebras, separándola de la otra. En resumen, DnaA y HU hacen que el DNA se doble y la tensión provoca que se forme un bucle.

A continuación, un hexámero - La DNA girasa (topoisomerasa) alivia la de la proteína DnaB (helicasa) tensión topológica creada por el se une a cada hebra con ayuda desenrollamiento del DNA. de la proteína DnaC. DnaB - Se une la DnaG (primasa) que desenrolla el DNA de forma sintetizará los RNA cebadores. Requiere bidireccional (2 horquillas de hidrólisis de ATP. replicación). Las hebras separadas son A partir de aquí comienza el siguiente paso: la estabilizadas por proteínas SSB elongación. (unen DNA monohebra).

Regulación: Todos los procesos que tienen lugar en la célula y que no son constantes, los que solo ocurren cuando son necesarios, están sometidos a regulación. La etapa principal para regular el proceso de replicación es en el proceso de inicio. Es el momento en que decide si replicar o no. El inicio de la replicación está regulado por distintos aspectos. El inicio de replicación es la única fase que está regulada y se realiza una sola vez en cada ciclo celular. La regulación se lleva a cabo por metilación del DNA y por interacciones con la membrana plasmática bacteriana. -

El origen de replicación oriC es metilado por la metilasa Dam: metila la adenina dentro de las 11 secuencias GATC presentes en oriC de E. coli. Inmediatamente tras la replicación, el DNA está semimetilado: hebras parentales metiladas y hebras de nueva síntesis sin metilar. Los oriC semimetilados son secuestrados temporalmente en la membrana plasmática (mecanismo desconocido) Tras unos minutos son liberados y metilados completamente por Dam antes de que DnaA pueda unirse a las cuatro secuencias de 9 pb para iniciar de nuevo la replicación.

Para que se favorezca que la región de origen de replicación sea reconocida correctamente y que no se confunda con otras secuencias parecidas que pueden existir, la célula afina el proceso de reconocimiento poniéndole una señal,

metilando. Ahondando en la abundancia de adeninas de esa región, justo antes de que la célula necesite replicar, aparecen hipermetilados. La hipermetilación de esta región favorece que la protgeina reconozca el sitio de replicación. Ahora bien, esta regulación está sometida al ciclo celular, en función de la fase. La célula no hipermetila y empieza a replicar en cualquier momento. Para que la replicación se inicie esas regiones aparecen hipermetiladas. Como la metilación es una marca que se introduce a posteriori de que una hebra se ha replicado, la hebra nueva no esta metilada. Eso significa que cuando la celula esta replicando el DNA, cuando termina, el DNA de las células hijas aparece hemimetilado, de forma que imposibilita el reconocimiento por parte de las DNAa, para que no intervengan. Esto permite a la célula asegurar que no va a comenzar un nuevo ciclo de replicación hasta que termina el anterior. Pero además, esos DNA mientras están hemimetilados quedan secuestrados (en el caso de procariotas) por parte de la membrana plasmática. Esa región hemimetilada queda atrapada (tener en cuenta que los procariotas no tienen membrana nuclear). Cuando termina la replicación, aparece una metilasa que ya se encarga de metilar las adeninas.

2. Elongación de la replicación Consiste en la síntesis de la cadena conductora y de la cadena rezagada. Aparece la intervención de la DNA polimerasa III. Síntesis de la cadena conductora: Síntesis de la hebra rezagada: se realiza de comienza con la síntesis de un manera discontinua: la primasa DnaG sintetiza un cebador de RNA (10 a 60 nt) por cebador para un fragmento de Okazaki. La DNA la primasa DnaG en el origen de polimerasa III extiende el cebador hasta el replicación. A continuación la DNA fragmento de Okazaki anterior. Un nuevo cebador polimerasa III adiciona se sintetiza próximo a la horquilla de replicación y dinucleótidos al cebador. La el proceso se repite. síntesis de la hebra conductora transcurre continuamente al ritmo de avance de la horquilla de replicación. Para que la replicación sea posible que ocurra simultáneamente en las dos hebras, en sentidos contrarios, mediante una sola polimerasa, en la naturaleza, la célula lo resuelve “engañando” a la DNA polimerasa, ya que la hebra rezagada forma un lazo (según últimos estudios) en el entorno del replisoma y cuando se está formando el fragmento de Okazaqui. La subunidad que está sintetizando la cadena continua no tiene ningún problema. Pero la subunidad que sintetiza la cadena rezagada, se encuentra con una hebra que adquiere forma de lazo en el preciso momento en que está pasando por la

abrazadera de la subunidad de la DNA polimerasa. De esta forma, queda orientada en la forma correcta para que la síntesis sea simultánea.

La DNA polimerasa III usa un juego de sus subunidades núcleo para la síntesis continua de la hebra conductora, mientras que el otro juego de subunidades núcleo circula entre un fragmento de Okazaki y el siguiente sobre el bucle formado por la hebra rezagada.

Cuando un fragmento de Okazaki está completo, la DNA polimerasa I, utilizando su actividad exonucleasa 5’3’ elimina el cebador de RNA y lo reemplaza por DNA. La mella restante es sellada por la DNA ligasa, que se activa cuando un extremo 3’-OH del nuevo fragmento de Okazaki alcanza el siguiente cebador

3. Terminación de la replicación Una vez terminada la polimerización. Cuando un fragmento de Okazaki esta completo, la DNA polimerasa I (utilizando su actividad exonucleasa 5’-3’) elimina el cebador del RNA y lo reemplaza por DNA. La mella restante es sellada por la DNA ligasa, que se activa cuando un extremo tres prima oh del nuevo fragmento de Okazaki alcanza el siguiente cebador. En este proceso se necesita activar a la DNA ligasa para que adquiera la energía que en otras circunstancias proporciona la ruptura del trifosfato. El cromosoma de E. coli es la única molécula circular de DNA de doble hebra. La replicación empieza simultáneamente hacia los dos lados del origen de síntesis y transcurre de forma bidireccional hasta que las dos horquillas de replicación alcanzan una región terminal en la parte del comosoma diametralmente opuesta al origen. Pero no siempre las dos horquillas de replicación terminan a la vez, es decir, no siempre llevan la misma velocidad de replicación. Esto se debe a que el DNA procariota está empaquetado, pero el nivel de empaquetamiento no es homogéneo para toda la estructura genómica. Además está relacionado con el nivel transcripcional de cada región. Las regiones que tienen los genes de transcripción temprana están más desempaquetadas. Pero no es que haya un reconocimiento de secuencias, sino un reconocimiento estructural que la propia célula tiene preparado. Todo esto justifica que en un momento dado haya una horquilla más avanzada que la otra.

En procariotas no hay una separación espacial entre la replicación y transcripción. En algunas ocasiones pueden llegar a ser casi simultáneos, cosa que en eucariotas no va a suceder. Esto hace que se retarde las regiones de replicación de unas regiones con respecto a otras. La replicación debería de parar en un punto diametralmente opuesto al origen de replicación. Pero cuando una va más rápido, puede pasar esa determinada zona. Para facilitar que el encuentro impone un impedimento estérico para que la replicación termine, la evolución ha añadido a los procariotas una región de terminación. La región terminal contiene múltiples copias de una secuencia denominada Ter (20 pb). Las secuencias Ter son sitios de unión para una proteína llamada Tus. Es una contrahelicasa que evita que se desenrolle el DNA e inhibe la actividad helicasa de la proteína DnaB. La primera horquilla de replicación que topa con un complejo Tus-Ter queda detenida. La segunda horquilla se detiene cuando se encuentra con la primera horquilla ya detenida. Las regiones terminales son unas secuencias de pares de bases con una ordenación de los nucleótidos muy conservadas, colocadas de forma contraria. Es decir, las de cada lado, paran a la horquilla que viene por el otro lado. Están de tal forma organizadas que permiten que con ellas interaccionen unas moléculas proteicas que son las proteínas TUS y las secuencias se llaman TER. Cuando las TUS reconoce a TER, la helicasa no puede seguir avanzando. Moraleja: los procariotas tienen regiones específicas de terminación que impiden que la replicación se continúe mas allá de donde ha de acabar. Los pocos centenares de bases entre las dos horquillas son replicados a continuación mediante un mecanismo desconocido. (Tienen que ser enzimas del tipo de las topoisomerasas). La separación de los cromosomas encadenados requiere la acción de la topoisomerasa IV. Los cromosomas separados serán segregados en las células hija en la división celular....