DNA Sequencing (Indonesian) PDF

Preview

Summary

XD DNA sequencing Plan 1 1Pendahuluan 1.1 Definisi DNA sequencing 1.2 Tujuan DNA sequencing 1.3 Berapa pasangan basa di genom ? 2 2 Metode cara kimia 3 3 Metode cara enzimatis: 3.1 Chain-termination method 3.2 Dye-Primers sequencing 3.3 Dye-Terminator sequencing 4 4 Case-study XD 1.1 DNA adalah poli...

Description

XD

DNA sequencing Plan

1

1Pendahuluan 1.1 Definisi DNA sequencing 1.2 Tujuan DNA sequencing 1.3 Berapa pasangan basa di genom ?

2

2 Metode cara kimia

3

3 Metode cara enzimatis: 3.1 Chain-termination method 3.2 Dye-Primers sequencing 3.3 Dye-Terminator sequencing

4 4 Case-study

XD

1.1

DNA adalah polimer dari Nukleotida

Sugar-phosphate backbone

Satu untai

5‟ end

Timina (T)

Adenina (A)

Sitosina (C)

Guanina (G)

Phosphate 3‟ end

Deoxyribose

Basa nitrogen

“Double helix” dibuat dari dua untai

XD

1.1

Definisi DNA sequencing

DNA sequencing adalah metode untuk penentuan urutan dari satu molekul DNA Sekuen DNA adalah rantai dari A, C, G dan T

Apakah sekuen DNA ini?

DNA sequencing

XD

1.2

Tujuan DNA sequencing

Tujuan paling penting DNA sequencing adalah mencari pattern yang diketahui di dalam sekuen Pattern ini bisa terlibat di fungsi biologis, antara lain: mengkode protein atau/dan RNA mengontrol eskpresi gen mengontrol replikasi DNA dll... Genetic disease bisa berasal dari SATU perubahan pada SATU basa Prognosa penyakit genetik pada manusia

Informasi dari DNA sequencing

Antibodies bisa dibuat dari sekuen DNA/RNA patogen Menahan penyakit Organisme-organsime berbeda dari sekuen DNA Membandingkan organisme-organisme Kloning molekuler perlu dicek pada sekuen DNA dll...

XD

1.2

Tujuan DNA sequencing

Genom dari lebih dari 180 organisme sudah diketahui Manusia, Beberapa jenis tanaman, Simpanse, Kucing, Anjin, Tikus, Ayam, Sapi, Beberapa ikan, Lalat, Yeast, Banyak jenis bakteria, jamur dan virus http://www.genomenewsnetwork.org/resources/sequenced_genomes/genome_guide_index.shtml

XD

1.3

Berapa pasangan basa (bp) di genom ?

Manusia 3 080 000 000 bp

Nol

Padi 466 000 000 bp

Simpanse 2 870 000 000 bp

Ayam 1 200 000 000 bp

Arabidopsis 120 000 000 bp

Ragi 12 100 000 bp

Tikus 2 600 000 000 bp

Alat 137 000 000 bp

E. coli 4 600 000 bp

Jagung 2 500 000 000 bp

Virus Influenza A 13 588 bp

2

DNA sequencing Metode cara kimia “Base-Specific Chemical Cleavage Method” Maxam-Gilbert

Metode yang memotong DNA dengan cara kimia di mana ada basa yang spesifik

1 DNA ditandai dengan radioaktivitas 32P

DNA sequencing

2

Autoradiography 1. DNA ditandai dengan radioaktivitas32P Metode-metode DNA sequencing menggunakan SANGAT SEDIKIT DNA (nanograms) Jadi, perlu metode untuk mendeteksi DNA yang SENSITIF sekali Biasanya, DNA ditandai dengan 32P yang RADIOAKTIF Radioaktivitas DNA yang ditandai dengan 32P diteteksi dengan autoradiography Salah satu film yang sensitif terhadap X-rays ditempakan di atas hasil elektroforesis Disintegrasi dari 32P membuat pattern di film X-ray

Film X-ray

Autoradiography Cassette

Cara autoradiography

Autoradiogram (Hasil autoradiography)

2

DNA sequencing Metode cara kimia 1. DNA ditandai dengan radioaktivitas 32P 2. DNA dipotong pada empat reaksi kimia

Pada basa G

Pada basa A atau G

Pada basa C atau T

3. Hasil empat reaksi kimia di-load di gel

Migrasi Fragmen DNA

Ukuran Fragmen DNA

Pada basa C

2

DNA sequencing Metode cara kimia 1. DNA ditandai dengan radioaktivitas 32P 2. DNA dipotong pada empat reaksi kimia

Pada basa G

Pada basa A atau G

Pada basa C atau T

3. Hasil empat reaksi kimia di-load di gel

4. “Membaca” sekuen DNA

Ukuran Fragmen DNA

Pada basa C

2

DNA sequencing Metode cara kimia

3

DNA sequencing Metode cara enzimatis

Metode enzimatis berdasarkan REPLIKASI DNA

Untai “Template” Untai baru

DNA polimerase MENAMBAHKAN nukleotida-nukleotida pada molekul DNA (disebut “primer”)

Dari 5‟ end ke 3‟OH end Pada untai yang baru

3

Replikasi DNA Sudah disalin ....ACG Untai baru

5„ end

Untai “Template” 3„ end

Nitrogenous base

DNA polimerase PERLU 3’ OH dari dNTP yang terakhir Untuk menembahkan dNTP yang selanjutnya Melalui formasi ikatan phosphodiester bond

Sugar Phosphate

3„ end

Nukleotida triphosphate (dTTP) akan diinkorporasi

5„ end

3

Replikasi DNA Sudah disalin

Sudah disalin ....ACG Untai yang baru

Untai baru 5„ end 5„ end

....ACGT Untai “Template”

Untai “Template” 3„ end

Untai baru Untai “Template”

3„ end

5„ end

3„ end

Nitrogenousbase base Nitrogenous

DNA polimerase PERLU 3’ OH end dari dNTP yang terakhir Untuk menembahkan dNTP yang selanjutnya Melalui formasi ikatan phosphodiester bond

Sugar Sugar Phosphate Phosphate DNA polimerase MENAMBAHKAN nukleotida-nukleotida Pada molekul DNA (disebut “primer sequence”)

3„ end 3„ end

DNA Polimerase

Pyrophosphate

3„ end

Nukleotida triphosphate (dTTP) akan diinkorporasi Nukleotida triphosphate (dTTP) 5„ end akan diinkorporasi 5„ end

5„ end

1980 Chemistry Nobel PrizeXD

3.1

DNA sequencing

Cara “chain termination”

3’ OH end Deoxyribo-nucleotide- triphosphate

Tidak ada 3’ OH end

Di-deoxyribo-nucleotide- triphosphate

Kalau ini adalah nukleotida yang baru ditembahkan pada untai baru

DNA Polimerase terus menambahkan dNTPs

DNA Polimerase berhenti menambahkan dNTPs

3.1

1980 Chemistry Nobel Prize

DNA sequencing

Metode “chain termination” Sekuen DNA yang kita ingin diketahui Primer yang ditandai dengan radioaktivitas 32P Tabung yang mengandung ddATP berisi semua untai DNA yang berahkir dengan ddATP Tabung yang mengandung ddCTP berisi semua untai DNA yang berahkir dengan ddCTP Tabung yang mengandung ddGTP berisi semua untai DNA yang berahkir dengan ddGTP

Salah satu dari empat ddNTPs ditembahkan pada empat tabung yang berbeda

Empat reaksi PCR memproduksi fragmen DNA

Tabung yang mengandung ddTTP berisi semua untai DNA yang berahkir dengan ddTTP

Fragmen-fragmen DNA dari empat reaksi PCR dipisahkan menurut ukurannya dengan elektroforesis gel poliakrilamida.

Hasil-hasil dari elektroforesis kemudian dideteksi dengan autoradiography.

1980 Chemistry Nobel Prize

3.1

DNA sequencing

Metode “chain termination” “Membaca” Sekuen A ddCGATGCGAGACT

ddGATGCGAGACT ddATGCGAGACT ddTGCGAGACT ddGCGAGACT

ddCGAGACT ddGAGACT

ddAGACT

G

C

G

T A

G

C

1980 Chemistry Nobel Prize

3.1

DNA sequencing

Metode “chain termination” “Membaca” Sekuen

1980 Chemistry Nobel Prize

3.1

DNA sequencing

Metode “chain termination” “Reverse-complement” Sekuen 5„ end

3„ end Adalah sekuen di untai BARU saja

A G C G T A G C 1. “Complement” Sekuen 3„ end

5„ end

Untai baru adalah complement dari untai “template” A menjadi T T menjadi A G menjadi C C menjadi G

T C G C A T C G 2. “Reverse” Sekuen 5„ end

Menulis sekuen sama dari 5’end ke 3’end 3„ end

G C T A C G C T

Sekuen ini adalah sekuen template

1980 Chemistry Nobel PrizeXD

3.1

DNA sequencing Metode “chain termination” With radioactivity or fluorescence Empat tabung diisi ingredien yang sama untuk reaksi PCR (Buffer, satu primer yang ditandai, 4 dNTPs, DNA Polimerase, template) KECUALI Setiap tabung mengandung SALAH SATU dari empat ddNTPs Elongasi akan berhenti setiap kali satu ddGTP, ddATP, ddTTP atau ddCTP yang ditambahkan

PCR product size

Isi dari setiap tabung di-load dalam satu dari empat well di gel Produk-produk PCR dipisahkan menurut ukurannya Resolusi: SATU pasang basa

Untuk melihat : Autoradiography atau UV Untuk membaca : Film X-Ray atau gambar gel

Baca dari terkecil ke terbesar = Baca sekuen

3.1

1980 Chemistry Nobel PrizeXD

DNA sequencing

Metode “chain termination”

1980 Chemistry Nobel PrizeXD

3.1

DNA sequencing

Metode “chain termination” Untuk menandai fragmen DNA:

Radioaktivitas

atau

fluorescence

Untuk memproduksi hasil yang bisa dilihat : Autoradiography

atau UV

Untuk membaca sekuen :

atau

film X-ray

gambar gel

Kekurangan Memakan waktu Menggunakan radioaktivitas - Bahaya Mennggunakan empat tabung dan empat jalur di gel per DNA Sekuen yang dibaca tidak panjang (max. 500 basa)

XD

3.2

DNA sequencing

Metode “Dye-Primer” Metode ini adalah metode Chain Termination yang diperbaiki Primer yang sama ditandai dengan empat FLUOROCHROME yang berbeda

Primer

Primer

Primer

Primer

Setiap fluorochrome tereksitasi oleh panjang gelombang yang spesifik, kemudian setiap fluorochrome akan mengemisikan sinar cahaya yang spesifik

Sinar laser digunakan untuk membedakan empat sinat cahaya tersebut

Satu-satunya tabung + jalur gel/capillary cukup

http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/ab/applications-technologies/pharma-biotherapeutics/DNA_sequencing.swf http://f1000scientist.com/article/display/18504/

XD

3.2

DNA sequencing

Metode “Dye-Primer”

Empat tabung diisi ingredien yang sama untuk reaksi PCR (Buffer, 4 dNTPs, DNA Polimerase, template) KECUALI 1. Setiap tabung mengandung SALAH SATU dari empat ddNTPs 2. Setiap tabung mengandung primer yang ditandai dengan SALAH SATU dari empat fluorochrome

Elongasi akan berhenti setiap kali satu ddGTP, ddATP, ddTTP atau ddCTP yang ditambahkan. Semua primer ditandai Semua fragmen ditandai juga

Elektroforesis: satu well untuk keempat reaksi

XD

3.2

DNA sequencing

Metode “Dye-Primer”

Electropherogram a plot of fluorescence units over time

XD

3.2

DNA sequencing

Metode “Dye-Primer”

Electropherogram a plot of fluorescence units over time

XD

3.3

DNA sequencing

Metode “Dye-Terminator” Metode ini adalah metode Chain Termination yang diperbaiki Setiap ddNTP ditandai dengan satu FLUOROCHROME

ddATP

ddGTP

ddCTP

ddTTP

Setiap fluorochrome tereksitasi oleh panjang gelombang yang spesifik, kemudian setiap fluorochrome akan mengemisikan sinar cahaya yang spesifik

Sinar laser digunakan untuk membedakan empat sinat cahaya tersebut

Satu-satunya tabung + jalur gel/capillary cukup

XD

3.3

DNA sequencing FLUOROCHROMES Contoh : dRhodamine Terminators

XD

3.3

DNA sequencing

Metode “Dye-Terminator”

Satu-satunya tabung diisi ingredien untuk reaksi PCR (Buffer, 4 dNTPs, primer, DNA Polimerase, template) DAN Keempat ddNTP yang ditandai dengan satu fluorochrome masing-masing

Elongasi akan berhenti setiap kali satu ddGTP, ddATP, ddTTP atau ddCTP yang ditambahkan. Keempat ddNTP ditandai Semua fragmen ditandai juga Elektroforesis: satu well untuk keempat reaksi

XD

3.3

DNA sequencing

Metode “Dye-Terminator”

Automated DNA sequencers can sequence up to 1000 bases from 384 different DNA per day

XD

4

DNA sequencing Case study #1 Apakah sekuen di dua sampel di gambar di bawah ini? Apakah ada perbedaan antara kedua sampel ?

XD

4

DNA sequencing Case study #3 Apa yang terjadi di sampel 2 di bawah ini ? Sampel 1

Sampel 2

XD

4

DNA sequencing Case study #4 Apakah sekuen ?

AC GT

XD

4

DNA sequencing Case study #5

Apakah sekuen untuk DUA sampel di gambar di bawah ini ? Apakah ada perbedaan antara kedua sampel ? Apakah konsekuensi pada sekuen protein ? Coding DNA Sekuen protein

AC GT

XD

4

DNA sequencing Case study #6 Apa yang terjadi saat sequencing sampel ? Apa yang harus diperbaiki untuk mengulangi DNA sequencing ini ?

XD

4

DNA sequencing Case study #7 Apa yang terjadi saat sequencing sampel ? Apa yang harus diperbaiki untuk mengulangi DNA sequencing ini ?

Yang pertama 20-50 nukleotida baik-baik saja, tapi tibatiba kromatogram menunjukkan puncak dicampur atau latar belakang yang mengerikan. The first 20-50 nucleotides are fine, but suddenly the chromatogram shows mixed peaks or terrible background.

XD

4

DNA sequencing Case study #8 Apa yang terjadi saat sequencing sampel ? Apa yang harus diperbaiki untuk mengulangi DNA sequencing ini ?

Urutan tampak hebat sampai Poly A(atau polyT), dan kemudian band-band naik dan jatuh dalam gelombang. The sequence looks great until it hits a polyA (or polyT), and then the bands rise and fall in waves.

XD

4

DNA sequencing Case study #9 Membandingkan sekuen normal dan sekuen mutan. Mengidentifikasikan mutasi di sekuen mutan....