Ensayo de Quimica-Seca PDF

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Ensayo de Química Seca en Nefrología...

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QUÍMICA SECA La química seca tiene entre sus ventajas la de no emplear reactivos químicos líquidos. Esto facilita la eliminación de desechos y, por tanto, la contaminación es mínima. Esta característica fue la que impulsó, hace décadas, el uso de las tiras reactivas, tanto por el médico en el consultorio como por el propio paciente en su casa, para determinar la glucosa en sangre y orina, lo cual ha contribuido al buen control de la glicemia en los pacientes diabéticos. Más tarde aparecieron los glucosímetros, que sustituyeron la lectura visual por la reflectometría. En la actualidad se encuentran en el mercado múltiples aplicaciones de la química seca que van desde las pruebas de embarazo hasta la detección de marcadores tumorales como el antígeno prostático específico (PSA). Se sugiere al lector que vea el tema de reflectometría, en el acápite de Análisis Instrumental. Se hace referencia a las nuevas tecnologías que se usan en química clínica y que han repercutido de manera positiva en el desarrollo de esta especialidad diagnóstica. Más adelante, en este capítulo y en capítulos posteriores, se expone cómo estas tecnologías han penetrado el resto de los campos diagnósticos del laboratorio como: hematología, hemostasia, inmunología, endocrinología, nefrología, oncología y farmacocinética. Los resultados son muy importantes: aumento de la calidad y disminución de los costos. El acortamiento en los tiempos de entrega de los resultados (turn-around-time) y la fusión de tales equipos automáticos, ha tenido también repercusiones muy importantes en la atención médica. Algunas definiciones nuevas comienzan a aparecer en la literatura especializada. Tal es el caso de la quimiohematología, como se denomina a la fusión de los analizadores químicos con los hematológicos, y a los que ya aparecen unidos en el mercado, los inmunológicos. La versatilidad del equipamiento automático se debe en gran medida al desarrollo de la informática y de otras tecnologías: 1. Aplicaciones de diferentes medidas para el aseguramiento de la calidad. 2. Uso de métodos fotométricos, fluorimétricos, quimioluminiscentes, electroquímicos y de la fotometría de reflectancia.

3. La posibilidad de incorporar la inteligencia artificial y, por esta vía, brindar información sobre el funcionamiento del equipo: capaz de seleccionar los resultados y de transferirlos a una red de procesadores, para que estén a la disposición de los médicos de cada una de las estaciones terminales cercanas o distantes. 4. Los microprocesadores que, entre sus múltiples funciones, le permiten al equipo la adquisición de datos, su organización y exposición al operador en la pantalla (monitor o display), así como interactuar con él por medio del teclado. Estos equipos (es decir, los microprocesadores) marcaron el cambio de la mecanización en automatización y permitieron compactar los equipos al sustituir válvulas, interruptores y cronómetros con el programa de computación (software). 5. Aplicación de los métodos matemáticos (quimiometría) a las determinaciones químicas.

y

estadísticos

6. Uso de los sensores que responden a los estímulos físicos con un impulso y que pueden ser electroquímicos y ópticos. 7. Uso del código de barras para la identificación única de muestras y pacientes. 8. Aplicación de la robótica, que consiste en el uso de robots durante el transcurso de procesos, transportación, manipulación individual de las muestras y mezclas de reacción. Aunque los robots son más lentos que el ser humano, son capaces de trabajar durante 24 horas sin detenerse. Un sencillo ejemplo lo constituye el brazo que sujeta a la pipeta de muestras de un analizador químico (figura 1.15).

Figura 1.15 Movimiento del brazo que sostiene la pipeta de muestra de un analizador químico. Ya es una realidad que la robótica aumentará la eficiencia de los laboratorios y liberará de tareas rutinarias a los profesionales que laboran en él; entonces estos podrán dedicarse al desarrollo de métodos e investigaciones, así como interactuar con el resto de los profesionales del hospital QUÍMICA

SECA

La tecnología de química seca tiene sus inicios en los años 70’s. En 1976 ya se tenían algunos avances pero fue hasta 1978 cuando realmente se hizo la introducción de esta tecnología. Actualmente se cuenta con un analizador automatizado que utiliza la tecnología de química seca, el cual emplea un sistema de multicapas en un soporte de plástico. Este contiene todos los reactivos necesarios para analizar la muestra, utilizando 10µL de suero, plasma, líquido cefalorraquídeo u orina, la cual es aplicada a una lámina o “slide” que contiene reactivos que permiten la detección y cuantificación del analito en estudio. Existen diferentes tipos de “slide”, dependiendo del tipo de análisis por

realizar: Colorimétricas la cual hace una determinación de punto final, ya que hace la medición una vez terminada la reacción, ejemplo: glucosa, ácido úrico, colesterol. Enzimáticas, se llevan a cabo varias lecturas durante el curso de la reacción, ejemplo: lactato deshidrogenasa, amilasa, lipasa. En ambas la concentración del analito se cuantifica a través de una medición espectrofotométrica. Potenciométricas, mide el diferencial de potencial entre la muestra y el fluido de referencia, por medio de un electrodo de ion selectivo. Permite medir la concentración de electrolitos.

Un “slide” típico consta de cuatro capas y se clasifican de acuerdo a la función que cumplan: Capa difusora: es una capa porosa que permite distribuir uniformemente la muestra además de funcionar como filtro, ya que no deja pasar moléculas como proteínas, lípidos, hemoglobina, o bilirrubina. Sirve también como pantalla para al reflexión de la luz.

Capa de reacción: contiene sustancias que pueden ser enzimas o cualquier sustancia química, que se encuentra en condiciones muy controladas que intervienen en la reacción. Capa indicadora: contiene el colorante para formar un complejo colorido, que será proporcional a la concentración del analito, la cual se cuantifica por espectrofotometría de reflexión. Capa de soporte: es la base de la laminilla donde están depositadas las demás capas. Está fabricada con un material de plástico transparente que permite que pase la luz para que la reacción pueda ser medida. La tecnología de química seca tiene varias ventajas: Excelente precisión y exactitud, el control de calidad, se corre una vez al día, la calibración es estable por seis meses o cada cambio de lote, utiliza 10µL de muestra por prueba y cada muestra usa una punta diferente disminuyendo el peligro de contaminación. El equipo es sencillo de utilizar, la manipulación de la muestra se reduce a colocar el líquido por analizar en el equipo, y programar los análisis deseados. ESÁNDAR Una Disolución Estándar es aquella que contiene una concentración conocida de un elemento a la que llamamos Patrón Primario que debido a su estabilidad se utiliza para valorar concentraciones de otras disoluciones. En química analítica, un estándar es una preparación que contiene una concentración conocida de un elemento específico o sustancia. Un estándar simple será la dilución del elemento o substancia en un disolvente neutro. No obstante, la mayoría de las muestras naturales contienen un variado rango de distintas substancias, y si se mide la concentración elemental, pueden tener una composición diferente de la que se utilice como estándar. Esto puede ocasionar inexactitudes, y algunas muestras son diseñadas específicamente para que sean lo más parecidas posible a la realidad. Se dispone también de materiales de referencia certificados que contienen concentraciones, verificadas de forma independientes, de elementos disponibles en distintas matrices o materiales de muestra CURVA DE CALIBRACIÓN

La curva de calibración es un método muy utilizado en química analítica para determinar la concentración de una sustancia (analito) en una muestra desconocida, sobre todo en disoluciones. El método se basa en la relación proporcional entre la concentración y una determinada señal analítica (propiedad). Conociendo esta relación, será posible conocer la concentración en una muestra dada mediante la medida de esa señal. La relación concentración – señal se suele representar en una gráfica a la que se le conoce como curva de calibración o curva de calibrado. Es imprescindible que la señal analítica utilizada mantenga una relación proporcional con la concentración. Las señales más utilizadas son aquellas cuya relación con la concentración es lineal, al menos en el rango de trabajo. Por ejemplo, una de las propiedades más utilizadas es la absorbancia (absorción lumínica) que suele mantener una relación lineal con la concentración de solutos en disoluciones. Al ser una relación lineal, se puede representar mediante una recta, de ahí que este tipo específico de curva de calibración se conozca también como recta de calibración. Preparación de patrones Para elaborar una curva de calibrado se parte de varias disoluciones con una concentración conocida de analito (la sustancia a medir). Estas disoluciones se conocen como disoluciones patrón. Se han de elaborar una batería de patrones suficiente para cubrir un rango que incluya la concentración esperada en las muestras desconocidas. Las concentraciones utilizadas en los patrones también han de estar dentro del rango válido para la técnica analítica que se va a utilizar. Es decir, han de estar por encima del mínimo de concentración de analito cuantificable por la técnica utilizada. Este mínimo es conocido como límite mínimo cuantificable. También ha de estar por debajo del límite de linealidad. La relación lineal entre concentración y señal no se suele mantener a altas concentraciones y el límite de linealidad marca la concentración máxima para la cuál la curva de calibración sería fiable.

Límites de una recta de calibración 2 Construcción de la curva: relación concentración de analito y señal analítica La curva de calibrado se construye midiendo la señal analítica en cada uno de los patrones previamente elaborados. En el eje de ordenadas se asigna el valor de la señal medida y en el eje de abscisas la concentración del patrón. De esta forma podemos señalar puntos en la gráfica según las coordenadas (concentración (x), señal (y)). A estos puntos podemos aplicar la regresión lineal, generalmente mediante el ajuste por mínimos cuadrados, para obtener la recta que los relaciona y su función.

Precisión se refiere a la dispersión del conjunto de valores obtenidos de mediciones repetidas de una magnitud. Cuanto menor es la dispersión mayor la precisión. Una medida común de la variabilidad es la desviación estándar de las mediciones y la precisión se puede estimar como una función de ella. Es importante resaltar que la automatización de diferentes pruebas o técnicas puede producir un aumento de la precisión. Esto se debe a que con dicha automatización, lo que logramos es una disminución de los errores manuales o su corrección inmediata. No hay que confundir resolución con precisión. Exactitud se refiere a cuán cerca del valor real se encuentra el valor medido. En términos estadísticos, la exactitud está relacionada con el sesgo de una estimación. Cuanto menor es el sesgo más exacta es una estimación. Cuando se expresa la exactitud de un resultado, se expresa mediante el error absoluto que es la diferencia entre el valor experimental y el valor verdadero Se entiende por Linealidad la capacidad de un método analítico de obtener resultados proporcionales a la concentración de analito en la muestra dentro de un intervalo determinado. Introducción Dicho de otro modo, la linealidad es la proporcionalidad entre la concentración del analito y la respuesta del método en un intervalo o rango de concentraciónes. El ensayo de linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones de concentraciones crecientes del analito que se determina o sobre muestras problemas a las que se han adicionado cantidades crecientes de un patrón del analito. En ambos casos el procedimiento se conoce como “curva de calibración” o “curva de calibrado”. Errores

determinados

o

sistemáticos

Son los errores del mismo signo debidos a causas definidas que influyen en el resultado, aumentando o disminuyéndolo. Estos errores generalmente se puede prever y eliminar o efectuar correcciones correspondientes. Señalemos los siguientes tipos de errores determinados..

Pasos generales para la realización de una curva de calibración Se prepara una serie de soluciones de un patrón del analito a concentraciones crecientes y se procede a su determinación en cada solución aplicando el método que se evalúa y obteniéndose para cada solución una respuesta o señal (mL consumidos, absorbancia, índice de refracción, etc.). el número de soluciones puede estar comprendido entre 6 y 10 y las concentraciones se seleccionan de acuerdo con las cantidades esperadas del analito en la muestra. Así por ejemplo, en el análisis de la linealidad de un método de determinación de proteínas solubles en un extracto proteico deharina de soya se preparan soluciones de una proteína patrón (albúmina de suero bovino) a concentraciones de 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1 mg/mL y se procede al análisis midiendo la respuesta del método analítico (pudiera ser una señal instrumental como por ejemplo absorbancia), para cada una de las soluciones preparadas. 2. Se determina la proporcionalidad existente entre la concentración y la respuesta del método analítico, calculando por el método de ajuste mínimos cuadrados la ecuación de regresión lineal del tipo. 1.

Sensibilidad

del

calibrado

La sensibilidad de calibrado se define como el coeficiente diferencial entre la señal medida (respuesta del método) y la concentración del analito,...