Enzimi PDF

Preview

Summary

Enzimi...

Description

ENZIMI Gli enzimi sono catalizzatori organici di natura proteica. Gli enzimi sono delle proteine che fungono da catalizzatori nelle reazioni organiche negli organismi viventi. Per la loro natura proteica sono delle strutture stereospecifiche, questo vuol dire che ogni enzima riconosce e agisce su un substrato specifico. La loro funzione è quella di velocizzare e controllare le reazioni chimiche necessarie per mantenere l’omeostasi cellulare. Senza di essi le reazioni avverrebbero in tempo più lunghi. L’attività catalitica delle proteine enzimatiche dipende dall’integrità della conformazione nativa. Affinchè un enzima funzioni correttamente è essenziale - che conservi la sua struttura nativa: struttura proteica tridimensionale attiva - che ci sia la presenza di diversi cofattori (componenti chimici addizionali) Esistono diversi cofattori. I cofattori possono essere - molecole inorganiche: ioni metallici, come il ferro e il potassio. - molecole organiche complesse: coenzimi, come le vitamine. Se un enzima viene denaturato o dissociato in subunità perde la sua attività catalitica. I coenzimi agiscono come trasportatori transitori di specifici gruppi funzionali. Un coenzima o uno ione metallico legato covalentemente alla proteina enzimatica è definito gruppo prostetico. Cosa è un OLOENZIMA? Enzima/complesso cataliticamente attivo formato dalla proteina e dal suo gruppo prostetico (coenzima+ioni metallici). Il gruppo prostetico è la parte non organica. L’emoglobina con il gruppo eme è un oloenzima. Cosa è un APOENZIMA? Proteina priva di gruppo prostetico, senza attività catalitica. È la parte proteica di un enzima, chiamata anche apoproteina. L’emoglobina privo del gruppo eme è un apoenzima. L’insieme dell’apoenzima e del cofattore viene detto oloenzima, enzima cataliticamente attivo. Si differenziano dai catalizzatori chimici non enzimatici per velocità, condizioni, specificità e controllo della reazione. PROPRIETÀ DEGLI ENZIMI - Elevato potere catalitico: la capacità di accelerare una reazione di molti ordini di grandezza pur operando in soluzioni acquose diluite e in condizioni blande di temperatura e pH. - Specificità: capacità dell’enzima di catalizzare una sola reazione e agire su un substrato specifico. - Regolazione: controllano i processi biochimici. -

Gli enzimi MODIFICANO la velocità delle reazioni ma NON gli equilibri.

La stereospecificità dipende dal fatto che le molecole enzimatiche posseggono siti attivi asimmetrici. Gli enzimi sono specifici perché c’è una complementarietà geometrica ed elettronica tra enzima e substrato basata su interazioni deboli. La specificità verso il substrato dipende dalla disposizione spaziale degli atomi che lo costituiscono (complementarietà geometrica) e dalla distribuzione dei gruppi funzionali (complementarietà elettronica). (Il sito di legame deve presentare complementarietà geometrica ed elettronica per accogliere il substrato). SITO ATTIVO O CATALITICO Una caratteristica delle reazioni catalizzate dagli enzimi è quella di avvenire all’interno dei confini di una tasca dell’enzima chiamata sito attivo. La molecola che si lega al sito attivo e su cui l’enzima agisce è detta substrato. La superficie di un sito attivo è rivestita da residui amminoacidici i cui gruppi funzionali costituenti legano il substrato e catalizzano la reazione chimica. Il sito di legame deve presentare complementarietà geometrica ed elettronica per accogliere il substrato. Quindi, il sito attivo/catalitico è una porzione di enzima a contatto con il substrato direttamente coinvolta nel processo catalitico. È un’entità tridimensionale che occupa una piccola porzione dell’enzima. - La tridimensioanlità rende conto della complementarietà geometrica e quindi della stereospecificità e della disposizione spaziale tridimensionale specifica che deve avere il substrato per legarsi all’enzima - Costituisce una cavità o fenditura non polare (che pu contenere gruppi polari). Il sito attivo, in particolare il sito di legame, lega i substrati mediante interazioni deboli. Il sito attivo è diviso in due zone: - sito di legame: sito in cui si lega il substrato - sito catalitico: porzione del sito in cui vengono esposti i residui amminoacidi che effettuano la reazione sul substrato che si è legato con il sito attivo. (sito in cui avviene la reazione) Gli enzimi sono classificati in base al tipo di reazione che catalizzano - ossidoriduttasi: reazione di ossidoriduzione - transferasi: trasferimento di gruppi funzionali - idrolasi: reazione di idrolisi - liasi: eliminazione di gruppi per generare doppi legami - isomerasi: isomerizzazione - ligasi: formazione di legami accoppiata all’idrolisi di ATP.

CINETICA ENZIMATICA

Energia di attivazione: differenza tra il livello energetico dello stato basale dei reagenti e dello stato di transizione (barriera energetica da superare perché avvenga la reazione). La velocità di una reazione dipende da questa energia. Un’elevata energia di attivazione corrisponde a una bassa velocità di reazione. - La velocità di una reazione può essere aumentata alzando la temperatura e/o la pressione. - L’energia di attivazione può essere abbassata aggiungendo un catalizzatore. - Il catalizzatore aumenta la velocità della reazione abbassando l’energia di attivazione. Stato di transizione: livello energetico che devono raggiungere le molecole affinché possa avvenire una reazione. Gli enzimi catalizzano reazioni esoergoniche = Una reazione avviene spontaneamente quando il ΔG’° è negativo (processo esoergonico). -

Gli enzimi non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto. Un enzima fornisce un percorso a bassa energia per convertire un substrato in prodotto, ma non influenza la variazione di energia libera complessiva della reazione. Gli enzimi non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare un nuovo ciclo.

1. INTERAZIONE ENZIMA-SUBSTRATO (ES) La formazione di ogni interazione debole nel complesso ES è accompagnata da un piccolo rilascio di energia libera, da cui dipende il grado di stabilità dell’interazione. L’energia che si libera dalle interazioni ES viene detta energia di legame. L’energia di legame liberata dalla formazione ES è la fonte principale di energia libera usata dall’enzima per abbassare l’energia di attivazione della reazione. Le interazioni deboli tra enzima e substrato diventano ottimali nello stato di transizione della reazione. Per poter catalizzare una reazione, l’enzima deve essere complementare allo stato di transizione, ciò vuol dire che le interazioni diventano ottimali solo quando il substrato raggiunge lo stato di transizione. Due modelli descrivono il fenomeno E-S - Modello della chiave nella serratura enzima complementare al substrato  la reazione non avviene: enzima e substrato hanno strutture complementari, non vi è modificazione conformazionale. Il sito attivo di un enzima non legato ha una forma complementare a quella del substrato. Un enzima di questo genere impedisce che avvenga la reazione, in quanto si ha una stabilizzazione del substrato. -

Modello dell’adattamento indotto enzima complementare allo stato di transizione la reazione avviene: comporta una modifica conformazionale, enzima e substrato si modificano a vicenda. Il sito attivo di un enzima assume una forma complementare a quella del substrato solo dopo che il substrato si è legato.

Gli enzimi sono molecole flessibili: la forma del sito attivo dell’enzima viene modificata dal legame con il substrato in un processo di riconoscimento dinamico.

Effetto di vicinanza e orientamento Una reazione avviene solo quando i reagenti sono in contatto secondo una relazione spaziale corretta. Affinchè avvenga la reazione ci deve essere un corretto orientamento e avvicinamento dei reagenti perché si devono collidere le due molecole. Gli enzimi in questione legano i substrati e li orientano correttamente. Quando si forma il complesso enzima-substrato (complesso ES) si ha una diminuzione dell’entropia e un aumento dell’entropia del solvente. La diminuzione dell’entropia che si ha con la formazione del complesso ES è compensata dalla stabilizzazione dello stato di transizione. L’energia di legame viene utilizzata per superare le barriere fisiche e termodinamiche di una reazione: 1. Riduzione entropica  l’energia di legame mantiene i substrati nella posizione corretta. 2. Desolvatazione  formazione di legami tra E e S portano alla rimozione di acqua dal substrato. 3. Adattamento indotto  l’enzima può subire cambi conformazionali, adattandosi al substrato. Ha lo scopo di posizionare i gruppi funzionali dell’enzima nell’orientamento corretto perché possa avvenire il processo catalitico. (Porta il sito attivo nella corretta struttura). 4. Stiramento o distorsione del substratola somma delle interazioni ES compensano le modifiche termodinamicamente sfavorite del substrato che nello stato di transizione può subire distorsioni. I gruppi funzionali catalitici di un enzima interagiscono temporaneamente con un substrato e lo “preparano” alla reazione formando il complesso ES. L’interazione tra enzima e substrato è mediata da legami deboli non covalenti. La formazione di tali legami è accompagnata da rilascio di energia libera che viene detta ENERGIA DI LEGAME e che costituisce la principale fonte di energia libera usata dall’enzima per abbassare l’energia di attivazione della reazione. CATALISI ENZIMATICA Per catalisi si intende un meccanismo chimico che prevede l’aumento della velocità della reazione grazie ad una sostanza, detta catalizzatore, che non viene consumata nel processo. Per catalisi enzimatica intendiamo la catalisi effettuata da enzimi, i catalizzatori proteici. I tipi di catalisi sono: - Catalisi acido-base Avviene per trasferimento protonico (stabilizza un intermedio carico). La catalisi acida è un processo in cui il trasferimento di protoni da un acido abbassa il ΔG dello stato di transizione di una reazione. La catalisi basica è tale se la velocità della reazione aumenta con la rimozione di un protone mediante una base. Il trasferimento di protoni è la reazione più comune in biochimica. -

Catalisi covalente Richiede un nucleofilo. Aumenta la velocità della reazione con la formazione temporanea di un intermedio covalente tra il catalizzatore/enzima e il substrato. In genere in tale

processo il nucleofilo è sul catalizzatore e un elettrofilo è sul substrato. E’ importante ricordare che maggiore sarà la stabilità di legame, minore è la facilità di rompere il legame. Le catene laterali aminoacidiche del sito attivo forniscono in genere centri nucleofili che subiscono modificazioni covalenti transitorie. -

Catalisi con ioni metallici come catalizzatori Qui intervengono i metalloenzimi di cui il metallo è il coenzima che sarà necessario per il legame con il substrato. I metalli possono: Agire come centri elettrofili Legare i substrati per orientarli correttamente e aumentare l’energia di attivazione Mediare reazioni di ossido-riduzione Stabilizzare cariche di segno opposto.

CINETICA ENZIMATICA È nata per studiare come la velocità di reazione varia in funzione dei parametri sperimentali. Enzima e substrato interagiscono per formare un complesso attivato (complesso ES) che andrà a formare il prodotto e rigenererà l’enzima. Uno dei fattori che modifica la velocità di una reazione catalizzata da un enzima è la concentrazione del substrato. La concentrazione del substrato varia durante il corso di una reazione, man mano che il substrato viene convertito in prodotto. Per eliminare questo problema si valuta la velocità iniziale.

La velocità di una reazione enzimatica in funzione del substrato segue un andamento iperbolico rettangolare. La velocità aumenta all’aumentare del substrato, ma quando la velocità non aumenta ulteriormente con l’aumentare del substrato e rimane costante si dice che c’è un effetto di saturazione cioè che l’enzima è saturato con il substrato. Per ovviare al problema si misura la velocità iniziale. Essendo un’iperbole dal punto di vista matematico non è facile determinare la velocità di ogni concentrazione per il substrato per vari motivi: poiché vi è l’effetto del prodotto sull’attività dell’enzima, le condizioni sperimentali, per una semplificazione dello schema di reazione… quindi per ovviare al problema si misura la velocità iniziale cioè velocità di reazione estrapolata al tempo zero, in questo caso la concentrazione dell’enzima attivo è uguale a quella nominalmente presente. La velocità iniziale è utilizzata per descrivere gli enzimi.

EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN (Km) L’equazione mette in relazione la velocità iniziale di una reazione enzimatica con la concentrazione del substrato. L’equazione descrive il comportamento cinetico degli enzimi non allosterici che presentano una relazione di tipo iperbolico tra velocità della reazione catalizzata e concentrazione di substrato. KM -

È La concentrazione del substrato alla quale V0 corrisponde a metà della velocità massima. È la misura dell’affinità tra enzima e substrato.

VELOCITÀ MASSIMA La velocità massima di una reazione si osserva a concentrazioni di substrato elevate, cioè quando l’enzima è saturato del tutto dal substrato ed è nella forma ES. La velocità iniziale non raggiunge mai la Vmax.

V0

=V [S] / [S] + K max m VERIFICA DELL’EQUAZIONE

V =V [S] / + K Se Km è molto più grande di S, S posso approssimarlo e diventerà 0 max m (andamento lineare del primo ordine) V =V Se Km è molto più piccola di S, KM posso approssimarlo e diventerà 0 max (aumentando il substrato la velocità diventa massima) V Se Km è uguale a S l’equazione diventa 0= ½ Vmax  questa è la Km. NB!!! Quando viene raggiunta la velocità massima? Quando tutto l’enzima è stato saturato con il substrato, e in queste condizioni [ES] diventa uguale a [Et]. La velocità iniziale massima della reazione catalizzata (Vmax) si osserva quando tutto l’enzima è presente nella forma di complesso ES e la concentrazione di E libero diventa trascurabile. In queste condizioni l’enzima è saturato con il suo substrato e quindi ulteriori aggiunte di substrato non avranno effetti sulla velocità della reazione. Quando il complesso ES si dissocia e si forma il prodotto P, l’enzima torna libero e pronto a iniziare un altro ciclo catalitico.

La cinetica di Michaelis-Menten viene detta anche cinetica dello stato stazionario.

L’effetto saturante del substrato è una proprietà caratteristica dei catalizzatori enzimatici ed è

responsabile dell’appaiamento della curva.

Quando l’enzima viene prima mescolato con un grande eccesso di substrato, vi è un periodo iniziale, chiamato stato pre stazionario, durante il quale avviene la formazione di ES (periodo molto breve poiché dura solo microsecondi). La reazione raggiunge rapidamente lo stato stazionario in cui la concentrazione di ES rimane approssimativamente costante nel tempo. Una volta che lo stato pre stazionario viene superato, viene generato il prodotto della reazione alla stessa velocità con cui viene consumato il substrato, solo se la concentrazione di ES rimane costante. La velocità iniziale della reazione riflette uno stato stazionario in cui la concentrazione di ES è costante. In queste condizioni la velocità di formazione del complesso ES diventa uguale a quella della sua demolizione. Questa assunzione si chiama ASSUNZIONE DELLO STATO STAZIONARIO. DOMANDA COMPITO: Che cosa si intende per stato stazionario in una reazione enzimatica? La velocità di formazione del complesso ES è uguale alla velocità della sua demolizione....