Enzymes de restriction PDF

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Les enzymes de restriction 1. Nomenclature BamHI : enzyme isolé de Bacillus amyloliquefaciens souche H et 1ère enzyme isolé de cette souche 3 classes enzymes de restriction :  Type séquençage reconnue  Nature clivage  Structure/composition holoenzyme Classe Site reconnaissance et clivage à

1000pb

Composition

Type I

Coupe brins reconnaissance

du

site 3 sous unité : activité reconnaissance, endonucléase et méthylase individuelle

Type II

Coupe brins à site reconnaissance Endonucléase et méthylase séparés. Enzyme spécifique, palindromique (4-8pb) dimère

Type III

Coupe 1 brin à 24 -26pb en aval site Endonucléase et méthylase complexe à 2 sous reconnaissance unité séparés

2. Enzyme type II Constitué 2 sous unité identique : homodimère Reconnaissance aspécifique ADN -> translation -> site restriction -> reconnaissance spé ADN -> changement conformation -> clivage liaison phosphodiester -> 5’PO4- et 3’OH 3. Facteurs influençant activité enzyme Type II utilisé pour digérer ADN Enzyme pour cliver ADN au site restriction besoin de :  Tampon bon pH (7 à 7,9)  10 nM MgCl2 (Mg : cofacteur pour clivage liaison phosphodiester)  0-100 mM NaCl  Température (37°C) Unité enzymatique : quantité enzyme permettant digestion 1 µg ADN phage en 1h à 37°C Enzyme dans condition non standard coupe ADN à site similaire mais pas identique au site restriction, c’est activité Star peut être du :  Concentration glycérol > 5 % v/v  Concentration trop élevé enzyme (>50-100 U/µg ADN)  Temps digestion trop long  Présence solvant organique (EtOH, DMSO, éthylène glycérol)  Utilisation autre cations divalent à la place de Mg2+ (Mn2+, Zn2+, Cu2+, Co2+) ADN méthytransférase : transfert groupe méthyl de S-adénosylméthionine à adénine/cytosine du site restriction -> protection ADN endogène. 3 DNA méthyltransférase :  Dam : DNA adénine méthylase : méthylation en N6 de A dans séquence GATC  Dcm : DNA cytosine méthylase : méthylation en C5 de C dans séquence de CCAGG/CCTGG  EcoKI 4. Isoschizomère, néoschizomère Isoschizomère : enzyme restriction qui reconnait même site et coupe même position Néoschizomère : enzyme restriction reconnait même site mais coupe position différente 5. ADN lignases Enzyme restriction laisse extrémités 3’OH et 5’PO4 2- peut être lié entre elle ou autre molécule Réaction catalysé par ADN ligases qui synthétise liaison phosphodiester entre 5’PO4 2- et 3’OH, c’est ligation. Quand extrémité franche ou cohésive complémentaire (plus facile). Rencontre entre extrémité fait par diffusion. Ligation seulement si 5’ phosphorylé

Ligase plus utilisé : phage T4 6. Facteur influençant ligation Efficacité dépend :  Concentration ADN, éviter formation oligomère (50 ng plamide si 3-8kb)  Ratio ADN vecteur et insert. Meilleure rendement avec ratio 1 :3 et 1 :5  Stratégie clonage. Préparation vecteur/insert influe sur nombre transformation Extrémité franche : ratio 1 :5, température 16°/4°, incubation nuit Extrémité cohésive : ratio 1 :3, température 25°, incubation 5min 7. Phosphatase Déphosphorylation catalysé par phosphatase qui hydrolyse liaison phosphodiester au 5’PO4 2Plus utilisé : phosphatase alcaline de crevette et d’intestin de vœux (CIAP)...