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Kapitel Aminosäuren, Peptide und Proteine
Wintersemester 20...

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2 Aminosäuren, Peptide und Proteine •

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Grundlagen: o protonierte Form einer Sä Säure, ure, wenn pH-Wert < pKS-Wert, deprotonierte Form der Säure, wenn pH-Wert > pKS-Wert o pH = pKS → Hälfte der ion ionisierbaren isierbaren Gruppe in protoniert protonierter er und Hälfte in deprotonierter Form o Geminale Diole dehydratisieren zu Ket Ketonen onen o Keton + primäres Amin → Imin o Oxidation vermindert die Zahl der C-H, S-H oder NN-H-Bindungen, H-Bindungen, Reduktion erhöht die Zahl o Thiol gutes Nucleophil, Br- gute Abgangsgrupp Abgangsgruppee o Amide in sauren Lösungen h hydrolysiert ydrolysiert in Natur vorherrschende M Makromoleküle akromoleküle Polysaccharide, Prot Proteine eine und Nucleinsäuren kürzere Vertreter der Pro Proteine teine als Peptide bezeichnet Peptide / Proteine = polymere Verbindungen aus Aminosäuren o Aminosäuren mit Amidbindungen verknüpft o α-Aminosäure = Carbonsä Carbonsäure ure mit Aminogruppe am α-C-Atom

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proteinogene Aminosäuren = AS, die von lebenden Zel Zellen len zur Synthese von Peptiden und Proteinen 23 Aminosäuren, die in Peptiden/Prot Peptiden/Proteinen einen vorkommen o insgesamt mehr als 250 α-Aminosäuren bbekannt ekannt mit biologischer Funktion o dazu andere AS, die nicht in α-Stellung Aminofunktion haben mit physiologische physiologischenn

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Funktionen Aminosäurepolymer aus beliebiger Anzahl Aminosäureresten o Dipeptid = 2, Tripeptid = 3, Tetrapetid ==4, 4, Pentapetid = 5, usw usw.. o Oligopeptid = 3 bis mehrere Dut Dutzend zend Amionsäurereste o Polypeptid = “viele” Aminosäurereste Proteine = Polypetide aus 40 bis 4000 Aminosäureresten Proteine und Peptide in Lebewesen viele Funktionen als Baustoffe und Funktionsträger

2.1 Klassifizierung und Nomenklatur der Aminosäuren •

20 häufigste Aminosäure Aminosäuren: n:

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unterscheiden sich nur in der Seitenkett Seitenkettee am α-C-Atom

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alle Aminosäuren außer Pr Prolin olin enthalten primäre Aminogruppe NH2 Prolin hat sekundäre Aminogruppe, die T Teil eil des 5-gliedrigen Ringes ist proteinogene Aminosäuren fast immer mit Trivialna Trivialnamen men bezeichnet o Glycin = „Süß“, Valin = Anl Anlehnung ehnung an Valinsäure (beide 5 C C-Atome), -Atome), Asparagin = Spargel, Tyrosin = Käse Einteilung der Aminosäuren in Gruppen o aliphatische Seitenkett Seitenketten en

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o alkoholische Seitenketten ▪ Serin = alkoholisches Derivat von Alanin, Threonin = hydroxylierte C2Seitenkette o schwefelhaltige Seitenket Seitenketten ten ▪ Cystein = Schwefelhomolo Schwefelhomolog g des Serins (anstelle OH Sulfhydryl Sulfhydrylgruppe) gruppe) ▪ Methionin = 2-(Methylthio)ethylseit 2-(Methylthio)ethylseitengruppe engruppe o saure Aminosäuren neben der Carboxylfunktion am α-C-Atom eine weite weitere re Carboxylgruppe in der Seitenkette ▪ Asparaginsäure = carboxyliert carboxyliertes es Derivat des Alanins • deprotoniertes Anion: Asp Aspartat artat ▪ Glutaminsäure = Asparagin Asparaginsäure säure + CH2 in der Seitenkette • deprotoniertes Anion: Glutamat o Säureamide (leiten sich von den sauren Aminosäuren ab) ▪ Asparagin = Seitenkettenamid der Aspar Asparaginsäure aginsäure ▪ Glutamin = Amid der Glutaminsäure o basische Aminosäuren ▪ Aminosäuren mit zwei basisch reagier reagierenden enden stickstoffhaltigen Gruppen ▪

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Lysin = ε-Aminogruppe am Ende der Seitenkette

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Arginin = δ-Guanidinogruppe

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ε und δ geben an, wie viel vielee C-Atome in der Seitenkette sin sindd

o Aminosäuren mit Phenylseit Phenylseitengruppen engruppen Phenylalanin = Phenylderiv ▪ Phenylderivat at des Alanins ▪ Tyrosin = para-Hydroxyphenyylalanin o Aminosäuren mit hetero heterozyklischen zyklischen Seitengruppen ▪ Prolin = Stickstoffatom im 5-Ring (sekundäre Aminogruppe) ▪ Histidin = Imidazolderivat des Alanin Alaninss • Imidazol = heterozyklische Verbindung mit aromatisch aromatischen en

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Charakter (Molekülring pl planar, anar, delokalisiertes πElektronensystem (Hückel-Regel), pKs ddes es protonierten Imidazolrings = 6 → sauer: protoniert, basisch: deprotoniert) Tryptophan = Indolderiva Indolderivat t des Alanins • Indol ist Aromat (freies EP des N-Atoms Teil des aromatischen π-Elektronensystems, seh sehrr schwache Base pKB = 16,4, unter physiologischen Bedingungen Indolring niemals protoniert)

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10 der 20 AS für den Men Menschen schen essenziell (**) o mit der Nahrung aufnehm aufnehmen, en, eigene Synthetisierung nicht ausreichend o Phenylalanin muss aufgenommen werden → Körper kann keine Phenylringe synthetisieren o Tyrosin aus Phenylalanin z zugänglich ugänglich (enzymatische Hydroxyl Hydroxylierung) ierung) o Arginin bei Wachstum in größeren M Mengen engen benötigt als alleine herstel herstellbar lbar in Natur findet man auch noch andere AS, doch deren Anzahl viel geringer als die der proteinogenen Aminosäure Aminosäurenn

2.2 Konfiguration der Aminosäuren • •

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α-C-Atom chiral substituiert (außer bei Glyci Glycin) n) o 19 der 20 AS bilden daher Enantiomere (D/L-Notation) Aminosäure in Fischer-Projektion: o Carboxylgruppe oben o Seitenkette R nach unt unten en o Carboxylgruppe und R ste stehen hen an den Enden der vert vertikalen ikalen Achse der Projektionsformel D-Aminosäure = Aminogru Aminogruppe ppe an horizontaler Achse rechts, H-Atom links L-Aminosäure = Amino Aminogruppe gruppe links, H-Atom rechts proteinogene Aminosäuren alle vom Typ L o weist auf gemeinsamen U Ursprung rsprung des Lebens aus ei einziger nziger Quelle hin D-Aminosäurereste in einigen Pepti Peptidantibiotika dantibiotika und Zellwänden von Bakterien (Teil von Pro Proteoglycan) teoglycan)

2.3 Säure/Base-Eigenschaften der Aminosäuren •

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Aminosäure = Carboxylgru Carboxylgruppe ppe + Aminogruppe o beide Gruppen können dep deprotoniert rotoniert (basische Form) und protoniert (azide Form) vorliegen protonierte Form einer Sä Säure, ure, wenn pH-Wert < pKS-Wert, deprotonierte Form der Säure, wenn pH-Wert > pKS-Wert o Carboxylgruppe der AS pKs-Werte ∼ 2 o protonierte Aminogruppen der AS pKs-Werte ∼ 9 o in sehr stark sauren Lösu Lösungen ngen (pH∼0) beide Gruppen protoniert o pH = 7: Carboxylgruppe de deprotoniert, protoniert, Aminogruppe proton protoniert iert o in stark basischer Lösung (pH∼11) bei beide de Gruppen deprotoniert

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o Aminosäure nie(!) als ungeladenes Teilch Teilchen en ▪ ungeladen wäre nur möglich, wenn schwache S Säure äure (pH 9) azider ist als starke Säure (pH 2) → uunmöglich nmöglich beim physiologischen pH-Wert von 7 liegt Alanin als doppelt geladenes Zwitter-Ion vor (streng genommen nur am isoelektrischen Punkt) o Zwitter-Ion = Verbindung Verbindung,, die negative Ladung an einem Ato Atom m und positive Ladung an einem anderen Atom h hat at einige Aminosäuren Seitenkett Seitenketten en mit dissoziablen H-Atomen o protonierte Imidazolring (Histidin) pHs-Wert = 6,04 ▪ Histidin in vier unterschiedlichen Formen je nnach ach pH-Wert

2.4 Der isoelektrische Punkt •

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isoelektrischer Punkt eine einerr Aminosäure = pH-Wert, bei dem keine Netto Nettoladung ladung vorliegt (Summe der elektrischen Ladungen = 0) o pI = pH-Wert, bei dem Te Teilchen ilchen keine Nettoladung tträgt rägt pI einer Aminosäure ohn ohnee dissoziable H-Atome in der Seitenkette o in der Mitte der beiden pK pKs-Werte s-Werte der vorhandenen dissoziablen Gruppen o lässt man pH-Wert von 2,34 aus anst ansteigen, eigen, erlangen immer mehr Carboxylgruppen negative Ladung o lässt man pH-Wert von 9,69 absinken, erlang erlangen en immer mehr Aminogruppen positive Ladung o Mittelwert = Zahl der negativ geladenen Gruppen gl gleich eich Zahl der positiv geladenen Gruppen

pI einer Aminosäure mit dissoziabler Grupp Gruppee in der Seitenkette o Mittelwert der pKs-Werte ähnlich ionisierend ionisierender er Gruppen (positiv geladene zu ungeladene, oder ungeladen ungeladenee zu negativ geladene) ▪ pI von Lysin: Mittelwert der pKs-Werte der beiden Gruppen, die unter sauren Bedingungen positiv geladen und unter basischen ungeladen sind ▪ pI von Gluatminsäure: Mi Mittelwert ttelwert der pKs-Werte der beiden Gruppen, die unter sauren Bedingungen ungeladen und unter basischen negativ geladen sind

2.5 Trennung von Aminosäuren •

Gemisch vers. Aminosäuren durch unterschiedliche Techniken aufgetrennt

2.5.1 Elektrophorese • • • •

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Trennung auf Grundlage dder er unterschiedlichen pI-Werte einige Tropfen Aminosäuregemisch in Mitte eines Filterpapieres oder Gel getropft wenn Filterpapier/Gel in Pufferlösung gelegt, an die über zw zwei ei Elektr Elektroden oden an gegenüberliegenden Seiten eine elektrische Spannung angelegt ist Aminosäure, deren pI über dem pH-Wert des Puffers liegt, trägt positive Nettoladung → wandern zum negativen Spannungspol (Kathode)

je weiter pI der Aminosäu Aminosäure re vom pH-Wert des Puffers entfernt, desto mehr positive Ladung am Aminosäuremolekül und desto weiter in Richtung Kat Kathode hode werden die Moleküle in bestimmter Zeit wandern Aminosäure, deren pI unter dem pH-Wert des Puffers liegt, trägt negativ negativee Nettoladung auf → wandern zum positiv positiven en Spannungspol (Anode) falls zwei Moleküle gleich gleichee Nettoladung haben, wandert größeres langsamer durch das Elektrophoresemedium (gleich (gleicher er Ladungsbetrag eine größere Masse zu beschleunigen) o bei sehr großen Molekülen kommt noch Porenweite des Mediums zum Tragen Frage: Wie Aminosäuren nach nachweisen, weisen, denn sie ergebe ergebenn farblose Lösungen o nach elektrophoretischer Trennung besprüht man Filterpapier mit Ninhydrinlösung und trockn trocknet et das Papier im Ofen ▪ meiste AS ergeben mit Ninhydrin purpurfarbenes Reaktionsprodukt ▪ Anzahl der verschiedenen AS iinn dem Gemisch = Anzahl Flecken • einzelne AS durch Vergleic Vergleich h mit Standard ermitteln

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Mechanismus der Umsetz Umsetzung ung einer Aminosäure mit Ninh Ninhydrin ydrin unter Bildung eines farbigen Produktes

o Schritte der Dehydratisierun Dehydratisierung, g, der Iminbildung und Iminhydrolyse weggelass weggelassen en (s. unten)

o für das Anfärben der Gele werden andere Farbstoffe eingesetzt

2.5.2 Papier- und Dünnschichtchromatographie • • • •

Papierchromatographie er erlaubte laubte einst Auftrennung von AS mit sehr einfachen Mit Mitteln teln Trennung auf Grundlage ih unterschiedlichen Polaritäten ihrer rer einige Tropen Aminosäurengemisch auf unteren Rand eines F Filterpapiers ilterpapiers Ende des Papiers nach de dem m Trocknen der aufgebrachten Probe in Behälter gestellt gestellt,, der mit einem Lösungsmittelgemisch gefüllt ist ist,, soweit dass das Papier etwas eintaucht o typisches Lösungsmittelgemisch: Wasser Wasser,, Essigsäure und Butano Butanoll

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Lösungsmittel kriecht durch den Kapill Kapillareffekt areffekt das Papier hinauf → Aminosäuren werden mitgeschleppt abhängig von der Polarität h haben aben AS unterschiedliche Affinit Affinitäten äten für die mobile Phase (das Lösungsmittel) im Verh Verhältnis ältnis zur stationären Phase (Filterpapier) → wandern unterschiedlich weit je polarer die AS, desto stärker von den polaren Molekülen des Papiers absorbiert je weniger polar die AS, desto weiter wand wandert ert sie im Lösungsmittelst Lösungsmittelstrom rom durch das Papier Papier nach der Beendigun Beendigung g der Trennung mit Ninhydrin „entwickelt“ → Farbfleck, der dem Auftragungspunkt des Gemisches am nächsten ist = stärkste po polare lare AS und am weitesten weg = wenigste polare AS Polarität: AS mit geladenen Seiten Seitenketten ketten > AS mit Seitenkett Seitenketten, en, die WBB au ausbilden sbilden >>AS mit Kohlenwasserstoffsei Kohlenwasserstoffseitenketten tenketten o je größer die Alkylgruppe, desto geringer die Polarität der AS o Leucin < Valin

Papierchromatographie ddurch urch Dünnschichtchromato Dünnschichtchromatographie graphie ersetzt (Thin Layer Chromatography) Dünnschichtchromato Dünnschichtchromatographie graphie = anstelle Filterpapier Glasscheibe mit aufgebrachter poröser Schicht als stationäre Phase o Glasscheibe dient nur als fester Untergrund o Trennung erfolgt über aufgestrich aufgestrichenes enes Material ▪ physikalischen Moleküleigenschaften h hängen ängen von Trägermaterial und Lösungsmittel (mobile Phase) ab

2.5.3 Austauschchromatographie • • •

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Elektrophorese und Dünnschich Dünnschichtchromatographie tchromatographie für analytische (kleine) Mengen präparative Trennungen ((größere größere Mengen auftrenn auftrennen, en, um weiter untersuche untersuchenn zu können) mit Ionenaustauschchromato Ionenaustauschchromatographie graphie Ionenaustauschchromatographie: o Chromatographiesäule, di diee mit einem unlöslichen Material (Harz) befüllt ist o Aminosäurengemisch auf Oberseite des Säulenmate Säulenmaterials rials gegeben und Abfolge von Pufferlösungen mit zunehmendem pH-Wert über di diee Säule gegossen o AS wandern mit untersch unterschiedlichen iedlichen Geschwindigkeite Geschwindigkeitenn durch das Säulenmateri Säulenmaterial al (stationäre Phase) Harz = chemisch inert inertes es Material mit elektrisch geladenen Seitenketten falls Gemisch aus Lysin und Glutaminsäure in einer Lösung von pH= pH=6 6 auf die Säule geladen, … o dann Glutaminsäuremoleküle schneller durch Säulenmaterial wand wandern, ern, weil ne negative gative Ladungen der Aminosäureseitenk Aminosäureseitenketten etten und die Sulfonsäure Sulfonsäuregruppen gruppen des Harzes sich abstoßen

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o dann Lysinmoleküle mit positiven Seitenk Seitenketten etten von dem negativ geladenen Harz angezogen und in Wanderun Wanderung g beeinträchtigt dieses Harz als Kationenaustauscher bezeichn bezeichnet, et, weil Na+-Gegenionen der Sulfonsäuregruppe (SO3 ) gegen positive Ionen der durch das Material wandern wandernden den Probe vertauscht werden

unpolares Säulenmaterial führt dazu, dass unpolare AS länger zurüc zurückgehalten kgehalten werden als polare Harze mit positiv geladener Gruppe sind Anionenaus Anionenaustauscher tauscher o Durchfluss der Anionen wi wird rd behindert, indem Anion Anionen en durch ebenfalls negativ geladenen, aber kleineren und damit mobileren Gegenionen ausgetauscht werden o Anionenaustauscherharz bspw bspw.. Dowex-1 (CH2N+(CH3)3-Gruppen am Trägermaterial und Chlo Chlorid rid als Gegenion) Aminosäureanalysator = Gerät, das a automatisierte utomatisierte Ion Ionenaustauschchromatoraphie enaustauschchromatoraphie durchführt o wenn Aminosäuregemisch durch die Trennwände eines Aminosäureanalysators mit einem Kationenaustauscher läuft, wandern AS mit unters. Geschwindigkeit o durch die Säule rinnende Fl Flüssigkeit üssigkeit (Eluat) in kleinen Portio Portionen nen (Fraktionen) aufgefangen → Aminosäuren Fraktion für Fraktion o jeder Fraktion Ninhydrin zugesetzt → M Menge enge der aufgefangenen AS photometrisch durch Messung der Lichtabsorptio Lichtabsorptionn bei 570 nm messen ▪ Reaktionsprodukt von Ninh Ninhydrin ydrin und AS hat Absorptionsmaximum bei 570nm o Info + Durchflussgeschwi Durchflussgeschwindigkeit ndigkeit = eindeutige Zuordnun Zuordnung g der AS und mengenmäßige Erfassung

2.6 Aminosäurensynthesen •

Austausch eines α-Wasse -Wasserstoffatoms rstoffatoms einer Carbonsäure durch ein Bromatom mittels einer Hell-Volhard-Zelinski-Reaktion → α-Bromcarbon -Bromcarbonsäure säure durch SN2-Reaktion mit Ammoniak zu Aminosäure umgesetzt

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Aminosäuren durch reduktive Aminierung von a-Ketosäuren

reduktive Aminierung

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mit deutlich besserer Ausbeute durch N-Phthalimidmalonestersynthese o Kombination der Malon Malonestersynthese estersynthese und Gabriel-Synthese o 1. Schritt: SN2-Reaktion von α-Brommalonest -Brommalonester er und Kaliumphthalsäureimid o 2. Schritt: vom α-C-Atom des N-Phthalimidmalones N-Phthalimidmalonesters ters spaltet leicht Proton ab, da von zwei Estergruppen flankiert o 3. Schritt: SN2-Reaktion von C Carbanion arbanion und Halogenalkan o 4. Schritt: erhitzen in angesäuert angesäuerter er wässriger Lösung → Hydrolyse beider Est Estererund beider Amidgruppen un undd Decarboxylierung der 3-Oxocarbonsäure

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Variante der N-Phthalimidmalonsäuresynt N-Phthalimidmalonsäuresynthese: hese: o anstelle N-Phthalimidmalonester Acetamidmalonester

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Strecker-Synthese o Aldehyd + Ammoniak → Imin o Cyanidaddition führt zur Zwischenst Zwischenstufe, ufe, die bei Hydrolyse AS ergibt

2.7 Racematspaltung von Aminosäuregemischen • • •

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Aminosäuren mit katalytisch katalytischer er Unterstützung von Enzymen → L-Aminosäuren Synthese von Aminosäuren im Labor → Racemat aus D-/L /L-Aminosäuren -Aminosäuren Enantiomere durch enzym enzymatische atische Unterstützung von voneinander einander getrennt Enzyme sind selbst chiral, deswegen rea o reagieren gieren sie mit Enantio Enantiomeren meren mit unterschiedlichen Geschwin Geschwindigkeiten digkeiten oder überhaupt nur mit einem der Enantiomere ▪ Aminoacylase katalysiert Hydrol Hydrolyse yse von N-Acetyl-L-aminosäuren, nicht die Hydrolyse von N-Acetyl-D-aminosäuren überführt man racemisch racemisches es Gemisch von AS in N-Acetylderivate und unterwi unterwirft rft die Reaktionsprodukte aminoa aminoacylasekatalysierter cylasekatalysierter Hydrolyse → Reaktionsprodukt freigesetzte L-Aminosäuren und N-acetylierte D-Aminosäuren o L- und D-Aminosäuren jetzt leich leicht t zu trennen Enantiomertrennung (Racematspalt (Racematspaltung) ung) hängt von den Geschwindigkeiten ab, mit der die N-Acetylderivate von dem Enzym umgesetzt werde werdenn → kinetische Racematspaltung

2.8 Peptidbindungen und Disulfidbindungen •

einzige kovalente Bindung Bindungen, en, die Aminosäuren in Peptiden und Proteinen verknüpfen

2.8.1 Peptidbindung • •

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Peptidbindung = Amidbindung, die Amino Aminosäurereste säurereste eines Peptids/Prot Peptids/Proteins eins untereinander zu einer unverzweigten Kett Kettee verknüpft freie Aminogruppe der N-terminalen Amino Aminosäure säure (in Zellen beginnt hier die Sy Synthese) nthese) am linken Ende und freie Carbo Carboxylgruppe xylgruppe der C-terminalen Aminosäure am rechten Ende

kennt man Reihenfolge de derr AS im Peptid nicht: durch Komma getrennt kennt man Reihenfolge de derr AS im Peptid: durch „-„ getrennt o beginnend mit der N-terminal N-terminalen en AS o Nummerierung der AS beg beginnend innend mit der N-terminalen AS o Nomenklatur: Endung „„--yl“ ▪ bspw. Valylcysteylalanylglu Valylcysteylalanylglutaminylhistidin taminylhistidin

o wenn nicht anders angegeben: L-Aminosäure

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Peptidbindung ca. 40% Do Doppelbindungscharakter ppelbindungscharakter infol infolge ge der Delokalisierung der Elektronen sterische Hinderung der cis-Konfiguratio cis-Konfigurationn → trans-Konfiguration der Amidbindung stabiler o deshalb α-C-Atome benach benachbarter barter AS trans-ständig

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partieller Doppelbindungsch Doppelbindungscharakter arakter schränkt freie Drehbark Drehbarkeit eit um die Peptidbindung ein → C-Atom und N-Atom der Peptidgruppe und die beiden damit verbundenen Atome relativ starr in einer Ebene örtliche Planarität beeinflusst die Art und Weise, wie sich AS-Ketten falten können Elektronendelokalisation hat Folgewirkung bzgl. der dreidimensio dreidimensionalen nalen Struktur von Peptiden und Proteinen

2.8.2 Disulfidbindungen • • •

Thioalkohole unter milden Bedingungen oxidiert → Disulfide Disulfid = Verbindung mit ein einer er Schwefel-Schwefel-Einfachbindung (S(S-S) S) bei Oxidation nimmt Zahl der S-H-Bindungen ab, bei Reduktion zu

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gebräuchl...