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Laboratorio de Fitoquímica II ANALISIS DE ALCALOIDES MEDIANTE EXTRACCIÓN POR LIXIVIACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LA ESPECIE “Erythroxylum coca”

DOCENTE: FERNANDO AGUDELO AGUIRRE

PRESENTADO POR: JUAN DIEGO TRUJILLO ROJAS

UNIVERSIDAD DEL QUINDÍO FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y TECNOLOGIAS QUÍMICA ARMENIA/QUINDÍO 28/ENERO/2019

Laboratorio de Fitoquímica II

RESUMEN. En el presente informe se enseñará el resultado del objeto principal que consiste en la identificación de los alcaloides presentes en la especie vegetal denominada vulgarmente como “coca” y conocida científicamente como Erythroxylum coca. Para poder realizar la identificación de estos alcaloides, el proceso consta de diversas etapas realizadas en el laboratorio como procesos de desengrasado, lixiviación, extracción liquido-líquido y concentración del extracto con el fin de llegar la obtención de los alcaloides en un solvente orgánico no polar. Al realizar cada una de estas etapas y extraer los alcaloides en el solvente orgánico se procede a realizar un análisis cualitativo para la identificación de estos implementando reactivos específicos para alcaloides como Drangendorff, Mayer y Bouchardat, donde al ser implementados en la identificación solo dos verificaron la existencia de estos (dragendorff y bouchardat) y uno no logro comprobar la identificación (mayer) dando como negativa dicha prueba. Al presenciar mediante el análisis cualitativo con los respectivos reactivos para alcaloides se procede a enviar el extracto obtenido a infrarrojo para identificar con el espectro el alcaloide presente en el extracto. INTRODUCCIÓN. La cocaína es un alcaloide pirrolidínico (comprendiendo los alcaloides del tropano) que igualmente como la gran mayoría de los alcaloides presenta un carácter básico, la cocaína es conocida como la benzoilmetilecgonina y contiene un nitrógeno heterocíclico, es extraído de una planta superior y presenta una actividad farmacológica muy marcada. Este alcaloide que presenta en mayor contenido el cual es la cocaína es un estimulante altamente adictivo presente en la naturaleza en la especie vegetal conocida científicamente como Erythroxylon coca o Erythroxylon novogranatense y vulgarmente coca. La panta es originaria y crece en los países de la región andina de América como también Sudamérica. Su nombre es proveniente de las culturas más desarrolladas del alto Perú, la Aimará, en donde se le atribuia el nombre KkoKa, el cual tiene significado de arbusto. Tradicionalmente, las hojas de coca se mastican o se toman como infusión a modo de té. [1] En los primeros años del siglo XX se utilizaba cocaína purificada en la mayoría de los tónicos y elixires preparados para tratar una amplia variedad de enfermedades, pues además de contener la cocaína en gran porcentaje logra contener varios componentes entre los que se encuentran taninos, flavonoides, monoterpenos, sesquiterpenos, aceites esenciales y gran variedad de alcaloides. Ciertas investigaciones han asegurado la existencia de una inmensa cantidad de metabolitos secundarios como alcaloides: Benzometilecgonina (cocaína), cis y trans- cinamilcocaína, B- truxilina, tropacocaína, benzoilecgonina, B- higrina, dihidrocuscohigrina; flavonoides como los O-conjugados del Eriodictiol y terpenos como β- pineno (monoterpeno), β- mirceno (monoterpeno), nerolidol (sesquiterpeno); en el aceite esencial también se encuentra Ácido esteárico, fitol, ácido metil éster 7, 10, 13 hexadecatrienoico y nonacosano. [2] En general, los alcaloides presentes en la hoja comprenden dos categorizaciones: derivados de la tropinona (cocaína, truxilina, tropacocaína y la cinamilcocaína) y derivados del pirrol (higrina y cuskigrina). Hay gran cantidad de especies vegetales la cual dicha existencia se aproxima a las 200 variedades estas, pero solo 4 producen dicho alcaloide. El contenido de alcaloides en la planta está entre 0,1 y 0,8 %, de los cuales el componente principal es la cocaína (0.5%-1% del alcaloide). [1] La planta de la coca es cultivada en Sudamerica y Java en alturas entre 600 y 1000 metros. Las hojas son particularmente grandes y gruesas, con forma de elipse ancha, más o menos puntiagudas y de color verde oscuro. Las de Erythroxylon novogranatense (Morris) Hieron son más pequeñas, estrechas y delgadas, tienen la punta más redondeada y son de color amarillo verdoso brillante. Las hojas de Erythroxylon novograntense var. truxillense (Rusby) Plowman son aún más pequeñas y estrechas. Sin embargo, son más gruesas que las de los otros tipos y tienen un vivo color verde.

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Figura 1. Planta de especie Erythroxylon coca y estructura molecular de la cocaína. [4] Se estima que su cultivo y consumo en el nuevo mundo data de 3000 años a.C, y que 500 años a.C. ya se usaba masivamente por pobladores de Colombia y Perú. En toda la región andina desde el norte de Chile hasta la sierra nevada de Santa Marta, la coca jugó un papel importante en las culturas nativas y se involucró en ritos y tradiciones indígenas [3]. Aunque los cultivos de coca fueron descritos por primera vez por el sacerdote español Tomás Ortiz en 1499 en las costas de América del Sur, en el año 1530 con la llegada de Francisco Pizarro a las costas del Perú se observó un gran comercio de la hoja de coca, la cual era considerada sagrada por los incas y su uso estaba restringido a los nobles, los demás solo tenían acceso a ella en caso de guerra o de trabajos muy duros [4]. Se le atribuye a Albert Nieman el aislamiento de la cocaína y su reconocimiento formal en 1859, posteriormente adquirió notoriedad como “sustancia inofensiva para curar la tristeza” y “alimento para los nervios”. En 1863 el francés Angelo Mariani, mezcló vino de Bordeaux con hoja de coca, produciendo un vino que fue reconocido durante más de 20 años como una excelente bebida tonificante para el cuerpo y el cerebro. Hacia 1890 existían ya numerosas bebidas con extractos de coca o cocaína entre ellas los licores Mariani y el French Wine of Coca (coca-cola) registrado y comercializado en Georgia (E.U.) en el año 1885 [5]. Existe una serie de mitos sobre el nacimiento de la planta, algunos cuentan relatos de mujeres, otros un poco más religiosos, sin embargo, el consumo de la coca puede haberse hecho importante en la vida de los incas como resultado del contacto que ellos mantuvieron con los indios que habitaban las laderas orientales de los Andes. La coca tuvo un significado religioso durante el periodo del imperio Inca y, aún después. Era una ofrenda mágica a los dioses, para fines tales como los de asegurarse una feliz travesía por los Andes y buena recuperación de la enfermedad. No obstante, es difícil determinar los distintos usos que los incas dieron a la coca debido a la inexistencia de un lenguaje escrito, sin embargo, hay razones para creer que se usó como analgésico. Por otra parte, la actitud de los conquistadores españoles con la coca fue ambivalente. [] Reconocieron que el hábito de consumir coca era importante para la salud y la motivación del indio andino; tiempo después se percataron cada vez más de que la coca era necesaria para reclutar indios para que trabajasen en las minas y sitios parecidos, donde las condiciones eran infrahumanas, el trabajo sumamente pesado y la comida muy escasa, por lo tanto, se permitió y se promovió el cultivo, producción y uso de la coca. Así mismo no tardaron en notar sus propiedades que inducen a la euforia. [7] Como alcaloide, la cocaína (Fig.1) se clasifica como pirrolidínico (comprende los alcaloides del tropano) de formula C17H21NO4, que como la gran mayoría de los alcaloides tiene carácter básico, contiene un nitrógeno heterocíclico [1]. Las dos formas químicas principales en que se presenta la cocaína son la sal soluble en agua y la cocaína base insoluble en agua. Generalmente, la cocaína en forma de sal puede inyectarse o aspirarse, mientras que en forma de base (“crack”) lo más frecuente es fumarla. Con el consumo excesivo o prolongado, la cocaína puede inducir el desarrollo de tolerancia, una fuerte dependencia psicológica, malnutrición, desorientación, alucinaciones y psicosis paranoide. [6]

Laboratorio de Fitoquímica II Los procedimientos utilizados para la extracción de los alcaloides se basan en la solubilidad y en la presencia del Nitrógeno en la molécula. La cocaína contiene una amina terciaria, hace que la base del alcaloide sea soluble en solventes orgánicos tales como cloroformo, éter etílico y etanol; y que forme sales solubles en agua con ácidos minerales como por ejemplo el HCl al 5%. La cocaína es cristalina, incolora o blanca (cocaína clorhidrato) o un polvo cristalino inodoro que funde entre 36 y 98 ºC; su solución saturada es alcalina a la prueba de tornasol. [6] OBJETIVOS. 

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Mediante los procesos experimentales de extracción líquido-líquido obtener el extracto vegetal el cual presentara los alcaloides y en mayor proporción la cocaína, esto mediante la implementación del material vegetal el cual es la hoja de coca (Erythroxylon coca). Realizar los procedimientos esenciales para la obtención del alcaloide de las hojas como lo es el desengrasado con solventes organicos como el éter de petróleo (bencina) mediante extracción por Soxhlet con el fin de eliminar los lípidos y ceras que abundan en el material vegetal. Posteriormente a la obtención del extracto vegetal concentrado realizar el análisis cualitativo implementando reactivos específicos de alcaloides como Mayer, Dragendorff y Bouchardat para así obtener con veracidad la presencia de los alcaloides en el extracto.

PROCEDIMIENTO. El proceso experimental realizado para la extraccion e identificacion de los alcaloides de la especie vegetal Erythroxylon coca se dividio en las siguientes etapas: -

Obtención y molienda del material vegetal.

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Desengrasado, lixiviación, concentración del lixiviado y acidulación.

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Basificación e identificación de alcaloides.

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OBTENCIÓN Y MOLIENDA DEL MATERIAL VEGETAL.

Para la obtención del material se tuvo que tener en cuenta el medio de uso, por ende, bajo una reglamentaria que presentaba la plaza de mercado mayorista de armenia (MERCAR) se logró la adquisición del material, pues la autorización brindada por la gerencia de la plaza mayorista se pudo recolectar la cantidad necesaria para la elaboración del proceso experimental. Ya al obtener de este, se procedió con a elaborar el siguiente método:

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Figura 2. Diagrama de flujo del proceso de recolección del material vegetal y molienda.

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DESENGRASADO, LIXIVIACIÓN, CONCENTRACIÓN DEL LIXIVIADO Y ACIDULACIÓN.

Para esta etapa experimental se siguió la metodología siguiente:

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Figura 3. Diagrama de flujo del proceso de desengrasado del material vegetal, lixiviación y concentración del lixiviado.

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BASIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES. Para esta etapa experimental se realiza lo siguiente teniendo en cuenta los reactivos específicos para alcaloides:

Figura 4. Diagrama de flujo del proceso de desengrasado del material vegetal, lixiviación y concentración del lixiviado. MATERIALES Y REACTIVOS. Tabla 1. Listado de materiales y reactivos utilizados para el aislamiento del derivado de nicotina. REACTIVOS Y MATERIALES

Laboratorio de Fitoquímica II Balanza de 200 g con tres cifras decimales 1 Balon de 500 mL y equipo soxhlet 1 Condensador de bolas y estufa eléctrica 1 Probeta 50 mL 1 Erlenmeyer 150 mL 1 Pera succionadora 1 Erlenmeyer 50 mL 1 Equipo para filtración al vacío (Buchner, erlenmeyer con desprendimiento lateral, bomba y manguera. 1 Pipeta de 5 mL graduada 1 pipeta de 10 mL graduada 1 Embudo de separación de 250 mL. 1 Pinza y su nuez 1 Aro para fijar el embudo de separación 1 Espátula metálica

Papel filtro (5 x grupo) 1 Equipo Rotaevaporador 1 Frasco lavador 500 mL de diclorometano 2.0 litros agua destilada 100 g de carbonato de calcio Recipiente para desechos químicos 500 g de hojas secas de coca 50 mL Éter de petróleo 500 mL de EtOH al 95% rectificado 50 mL de HCl [concentrado] y diluido Reactivo de Mayer Reactivo de Dragendorff Reactivo de Bouchardat

OBSERVACIONES. Para la realización experimental de la extracción de los alcaloides presentes en las hojas de coca se observaron diferentes características como igualmente al proceder a la identificación de los alcaloides presentes en la especie: -

Mediante la obtención del material (el cual fue brindado por la gerencia de la plaza de mercado mayorista MERCAR bajo un reglamento de uso) se llevó a cabo el secado de las hojas exponiéndolas al sol durante 3 a 5 días, las cuales en ese lapso de tiempo perdieron su total humedad, se tuvo que percatar la finalización del secado al observar en estas el crecimiento en algunas hojas con hongos, por ende, mediante selectividad se tomaron las hojas secas en perfecto estado.

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Al finalizar con la selección del material vegetal seco en buen estado, se inició con la molienda de este con licuadora en donde se percató que dicho material quedara finamente dividido (se realizó molienda 3 veces hasta conseguir que el material estuviera finamente dividido). Al presenciar el material molido se llevó a un tamizaje en donde se percató que el tamaño de partícula estuviera de acuerdo al número de tamiz implementado (Tamiz N° 10 con diámetro de 2.0 mm), es decir, que mediante este tamizaje se deseó obtener el material más finamente divido descartando el que no logrará ser tamizado.

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Al tener el material totalmente molido y finamente divido, este es adicionado a un dedal con el fin de realizar el desengrasado mediante extracción por soxhlet, para poder desengrasar el material con el fin de eliminar los lípidos (grasas) y ceras se adiciona bencina (éter de petróleo) en el balón, el desengrasado tiene una duración de 10 horas aproximadamente, en esta etapa la matriz compleja del material al perder lípidos y ceras iba cambiando el color, atenuándose y tomando un aspecto áspero o seco en mayor cantidad.

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Al tener el material vegetal libre siendo considerado como una matriz sin grasas y ceras, se continua con la etapa fundamental en donde se toma el material y es adicionado en un embudo para proceder a la lixiviación teniendo en cuenta en realizar el uso del solvente con el que se hará, el solvente a implementar es el etanol al 95% pero en donde este anteriormente es rectificado. Para la etapa de lixiviación es esencial implementar la bolsa de suero, en donde se harán las etapas sucesivas del paso del solvente por el material vegetal para así obtener el extracto a mayor concentración de alcaloides. La etapa de lixiviación tiene una duración de 14 días en donde se iba notando que el extracto obtenía mayor concentración y notando que la coloración aumentaba siendo un color verde oscuro.

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Después de los días de lixiviación se toma el extracto y se realiza con el rotaevaporador la concentración del extractor para así luego tener este en menor proporción y sin tanta cantidad del solvente con el que se extrajo.

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Al tener el extracto concentrado se le adiciona ácido clorhídrico al 0,5 N con el fin de realizar la etapa de acidulación, posterior a ello se toma y se deja en reposo durante un día para una buena elaboración del proceso.

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Al terminar la acidulación se centrifuga para eliminar el resto de material que se encuentra en tamaño partícula e igualmente los desechos que están presentes en el extracto acidulado, después de esto se basifica para obtener el extracto a un pH de 14.

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Al basificar se debe realizar la extracción líquido-líquido utilizando como solvente orgánico diclorometano, la extracción realizada es múltiple esto con el fin de tener los alcaloides en la fase orgánica e eliminar los desechos en la fase acuosa. Al tener los alcaloides en la fase orgánica se concentra mediante calentamiento con estufa para así eliminar las trazas del solvente que pueden estar presentes en el extracto.

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Cuando se presenta la fase orgánica con los alcaloides en mayor concentración se inicia con el análisis cualitativo mediante el implemento de los reactivos específicos de alcaloides como lo son Bourchardat (A), Drangendorff (B) y Mayer (C) para así determinar la veracidad de la presencia de los alcaloides que se encuentran en la especie vegetal manipulada para la identificación de estos. El uso de estos se debe tener en cuenta que antes de estos se toma el extracto y es adicionado una mínima cantidad en la placa escavada, ya a estar en la placa se es adicionado unas gotas de HCl para poder determinar los alcaloides en forma de sal y puedan dar positivo con el reactivo a implementar con unas gotas y se pueda dar la identificación de estos.

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Pruebas de identificación de alcaloides: (A) Bouchardat: prueba positiva con formación de precipitado y solución de color marrón (B) Dragendorff: prueba positiva con formación de precipitado y color de solución naranja con tonalidad un poco oscura. (C) Mayer: prueba negativa sin formación de precipitación de color crema.

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(A)

(B)

(C)

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Figura 7. Proceso experimental de la extracción de los alcaloides presentes en la coca (Erythroxylon coca) y análisis cualitativo con reactivos específicos de alcaloides para su identificación. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS. Se tiene que tener en cuenta que el tamizaje fitoquímico es un proceso de gran utilidad ante el análisis de una especie vegetal para determinar los compuestos que esta presenta con funciones ecológicas específicas como atrayentes y repelentes de animales, proporcionando a la planta sabores amargos, haciéndolas indigestas o venenosas (metabolitos secundarios), esto mediante etapas de elaboración experimental realizando técnicas extractivas, de separación, purificación y posterior aislamiento como de igual forma el análisis o identificación de los metabolitos secundarios para comprobar la presencia de estos. Los principios activos de una planta por lo general demuestran una naturaleza química distinta entre ellos, primordialmente ante la existencia de diferencia en su polaridad, siendo esta la razón fundamental ante el uso de distintas metodologías extractivas y de purificación para cada grupo de ellos de acuerdo con la solubilidad y posterior separación individual. Los solventes están caracterizados ante la penetración celular y llegada al citoplasma para la extracción de los metabolitos secundarios, los cuales se atraen o relacionan a las moléculas del solvente, pero dependiendo de su polaridad y constante dieléctrica, ya que estos dos son proporcionales. En la maceración de las hojas de E. coca se usa principalmente alcoholes como etanol o metanol, los cuales son polares y tienen la capacidad de extraer los compuestos con polaridad semejante, en este caso flavonoides, taninos, alcaloides, entre otros.

Laboratorio de Fitoquímica II Los alcaloides se solubilizan de acuerdo al pH, son hidrosolubles a pH ácidos y solubles en compuestos orgánicos a pH alcalinos. En las plantas generalmente están en forma de sales. De igual forma, estos pueden ser encontrados como bases libres, como sales de ácidos orgánicos, en distintos órganos de la planta (semillas, frutos, hojas, tallos, raíces o rizomas) o como combinaciones solubles de otras sustancias. Las sales son solubles en agua, en tanto que las bases libres lo son en solventes orgánicos tales como éter, acetato de etilo, cloroformo e insolubles en agua. La extracción se puede realizar ya sea tratando la droga por un solvente orgánico después de haber puesto en libertad la base de sus combinaciones por un álca...