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EXTRACCIÓN DE CASEÍNA DE LA LECHE, HIDRÓLISIS Y ANÁLISIS DE AMINOÁCIDO POR CROMATOGRAFÍA. 1. Objetivo de la práctica.  Extraer la proteína caseína de la leche.  Realizar la hidrolisis ácida de la caseína.  Realizar un análisis cromatografico de la caseína. 2. Estructura, propiedades y usos de la caseína. Referencia [1]: La caseína es una proteína que está en la eche, forman unidades compactas en forma esférica.

Caseína Propiedades: La caseína es una proteína de la leche, del tipo fosfoproteína, que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. La Caseína al ser un heteroproteido ya que su hidrólisis proporciona, además de aminoácidos, otras sustancias no proteicas. Concretamente es un fosfoproteico, lo que significa que posee grupos fosfatos unidos a alguna de las cadenas laterales de los aminoácidos, principalmente a los grupos hidroxilo de la serina y la treonina. Por lo general en la leche es su estructura se puede observar cuatro caseínas diferentes conocidas como: α, β, k se diferencia en sus pesos moleculares y en la cantidad de fosforo que contienen. Tabla 1: partes de la casina. Caseína M (g/mol) Grupos fosfatos

α 27300 9

β 24100 4-5

k 800 1,5

Usos: Debido a su naturaleza es coloidal y plasticidad y sus propiedades adhesivas hacen que sea aplicada en innumerables áreas de la industria: como preparación de adhesivos, se emplea para fabricar pinturas especiales y en el apresto de tejidos, la clarificación de vinos, la elaboración de preparados farmacéuticos y la fabricación de plásticos. Se usa para solidificar aceites minerales, para placas fotográficas, preparación de pastas, pomadas y cremas para la cara. En la preparación de pomadas para la industria de los insecticidas y fungicidas, como emulsificador de aceites minerales. PARTE EXPERIMENTAL pág. 1

a. Extracción de la caseína Diagrama del proceso químico. Leche Descremada (Gloria Súper light) I.

Extracción i) ii) iii) iv)

Calentar aprox 40°C. Ácido Acético al 10% gota a gota. Agitación constante. Reposo.

Caseína en Solución Solución Orgánica (L

t

t

II.

Separación i) Filtración al vacío. ii) Secado a 40° por 30´

)

Caseína +pequeñas cantidades de grasa III.

Desengrasado i) N-hexano (2 veces) ii) Agitar por 10min. iii) Decantar N-hexano.

N-hexano + grasa

Caseína + Restos de N-hexano IV.

Secado i)

Caseína desengrasada

3.

Observaciones experimentales. pág. 2

Secar a temp. Ambiente por 3 días.

i.

Precipitación de la caseína y punto isoeléctrico. Punto isoeléctrico: punto en el cual se considera neutra (ion dipolar) es decir, la forma catiónica y anionica son iguales.

Punto isoeléctrico de la caseína pH=4.6    

Características (marca, densidad) de la materia prima. Color: blanco amarillento Marca: leche gloria súper light Densidad: 1,03 g/ml

 Observaciones experimentales y comentarios Al añadir el ácido clorhídrico empezaba a precipitar un sólido color blanco, peo cuando se le adiciona hasta alcanzar un pH menor al 4.6, luego de la formación del precipitado lo filtramos. Luego añadimos el n-Hexano (V=15ml) se observa en la solución de n-Hexano que parte de la grasa que está siendo arrastrado de la caseína, después de decantar la solución de n-Hexano y secarlo a la estufa, temperatura menor a 40ºC, se pesa obteniendo lo siguiente: ii. Peso y características del producto obtenido. 

Se obtuvo 20.05 g. de caseína. Este es un sólido delgado, duro, amorfo y de color parecido a la leche. Es de color crema.

iii. Rendimiento del proceso : 

Peso de la caseína obtenida: 20.05g



Peso de la materia prima: D leche=

m leche , V

m leche=D leche .V =1.03

g .100 ml ml

pág. 3

m leche=103 g

Entonces el rendimiento es: 20.5 g Rendimiento ( % )= .100 % 103 g Rendimiento ( % )=19,9 % Comparado con lo que dice la etiqueta de la leche, el cual tiene un 18,3% de proteínas y carbohidratos (anexo 1), con lo cual concluimos que se pudo extraer gran parte de la caseína de la leche. b. Hidrolisis de la caseína: 4.

Observaciones experimentales. Al someter a reflujo la mezcla reacciónalo (0.5g de caseína, agua y 20ml de ácido clorhídrico al 19%), por unos 35minutos, esta mezcla cambia de un color crema a un marrón oscuro. Al agregarle carbón activado la solución adquiere un color negro y luego al filtrarla esta tomo un color amarillo claro.



Variables en el uso del carbón activado Referencia [6] Los colores que se manifiestan en líquidos suelen ser moléculas de tamaño relativamente grande. Por lo tanto, se adsorben en poros grandes, lo que hace que los carbones más adecuados para retenerlos sean los de mayor macroporosidad. Los carbones de madera, particularmente los de maderas no muy duras (como pino) que se activan químicamente, son los más macroporosos y, por lo tanto, son los más adecuados para decolorar. El problema de estos carbones es que son poco duros y poco resistentes a la abrasión, lo que obliga a aplicarlos en forma de polvo. Cuando se requiere que el carbón decolorante sea granular, la mejor alternativa suele ser un carbón de lignita. Es el carbón mineral de mayor macroporosidad.

5.

Ecuación de hidrolisis.

Mecanismo de reacción:

pág. 4

i

ii

ii i

iv

6. Test de Biuret

pág. 5

i

ii

iii

iv

Al agregar el Cu2+ se tendrá la formación de un complejo en donde tendremos la formación de un quelato (compuesto quelato el cual, tendrá un color característico entre azul y violeta). c. Análisis Cromatografico de Aminoácidos pág. 6

7. Resultados experimentales i. Descripción de placas cromatografías desarrolladas  La comparación se realizó con las siguientes proteínas.

Glicin a

Lisina

Cistina

Prolin a Grafica 2: aminoácidos a usar

 Características de las placas: Nosotros utilizamos para cromatografía un papel cromatografico de 12 x 17 cm.  -

Eluentes: Usamos una mezcla de solventes. Ácido Acético glacial (5 mL) n-butanol (25 mL) Agua (20 mL)

 Revelador: Se utilizó como revelador 2% de ninhidrina en etanol. 

Grafica de las placas cromatograficas.

pág. 7

Grafica 1: cromatografía experimental (anexo 2) Al ver nuestra placa, podemos decir que nuestra muestra (caseína) contenía los siguientes aminoácidos: Glicina, Lisina, Cistina y Prolina. A continuación presentaremos una comparación de los Rf obtenidos y los teóricos expuesto del autor Pavia.

Tabla 2: Rf experimentales vs Rf teórico. Aminoácidos Glicina(1) Lisina (2) Cistina (3) Prolina (4)

Rf Experimental 0.27 0.39 0.10 0.66

8. Revelado de la reacción. i. Ecuación de la reacción.

ii. Mecanismo de reacción. Referencia [2]

i

ii

pág. 8

Rf Teórico 0.42 0.53 0.16 0.85

iii

iv

v

vi

vii

vii i

pág. 9

ix

x

Cuestionario P1. Procedimiento de Extracción de la Caseína: i)

Cite otro texto de Química Orgánica experimental, diferente a pavia o Rendina 1974, en el cual se presente la “extracción de la caseína” y adjunte fotocopia respectiva.

Métodos de extracción de fracciones de caseína a partir de leche y caseinatos y producción de productos novedosos. Referencia [3] La presente invención se refiere a un método novedoso para precipitar de manera selectiva fracciones de caseína a partir de leche desnatada o caseinatos mediante la adición de una sal de calcio a pH alcalino. La leche en sí es una mezcla relativamente compleja, siendo los constituyentes principales grasa, minerales, azúcar (lactosa) y proteína. Las proteínas están presentes en la leche a una concentración de aproximadamente 35 g/l, y pueden dividirse de manera conveniente en dos clases principales -las caseínas, que quedan retenidas en la cuajada, y las proteínas de suero, que se mantienen en el líquido residual durante la fabricación del queso. Las caseínas representan el 80% de la proteína en la leche y se encuentran, junto con gran parte del calcio y fosfato, en partículas coloidales de tamaño submicrométrico, que se denominan micelas de caseína. La dispersión de la luz por las micelas de caseína da a la leche su apariencia blanca característica. Cuando se acidifica la leche hasta pH 4,6, el fosfato de calcio se disuelve de las micelas de caseína y se deteriora la estructura micelar, provocando que la caseína se agregue y precipite. Este procedimiento se usa en la fabricación de caseinato de sodio, que se prepara volviendo a suspender el precipitado de caseína ácido en solución acuosa mediante la adición de hidróxido de sodio hasta aproximadamente pH 7,0, seguido por secado. Otras pág. 10

formas de caseinato con propiedades funcionales diferentes, tales como caseinato de calcio o caseinato de amonio, pueden obtenerse ajustando la caseína a pH 7,0 con el hidróxido de calcio o amonio apropiado. Los caseinatos se usan en la fabricación de una amplia variedad de alimentos procesados cuando se hace uso de sus excelentes propiedades espumantes, emulsionantes y de unión a agua.

iii) Señale las diferencias más importantes entre ambos procedimientos. DIFERENCIAS: Procedimiento en el laboratorio

Procedimiento de producto novedosos

Precipitación de la caseína con Ácido Acético al 10%

Precipitación de la caseína con HCl.

Test de biuret

Prueba con AgNO3

Desengrase con N-Hexano

Suspensión de la caseína con alcohol etílico y éter.

P2. HORMONAS Y ENZIMAS. b) HORMONAS. Referencia [4] Las hormonas son sustancias químicas producidas por el cuerpo que controlan numerosas funciones corporales. Lo esencial en Sistema endocrino y aparato reproductor. Las hormonas actúan como "mensajeros" para coordinar las funciones de varias partes del cuerpo. La mayoría de las hormonas son proteínas que consisten de cadenas de aminoácidos. Algunas hormonas son esteroides, sustancias grasas producidas a base de colesterol. Las hormonas van a todos lugares del cuerpo por medio del torrente sanguíneo hasta llegar pág. 12

a su lugar indicado, logrando cambios como aceleración del metabolismo, aceleración del ritmo cardíaco, producción de leche, desarrollo de órganos sexuales y otros. Funciones que controlan las hormonas Entre las funciones que controlan las hormonas se incluyen:  Las actividades de órganos completos.  El crecimiento y desarrollo.  Reproducción  Las características sexuales.  El uso y almacenamiento de energía  Los niveles en la sangre de líquidos, sal y azúcar. Clases y clasificación de Hormonas Inicialmente las hormonas se clasificaban en tres grupos de acuerdo a su estructura química: hormonas peptídicas y proteicas, las hormonas asteroideas y las hormonas relacionadas con aminoácidos. En vertebrados se clasifican en:  Aminas  prostaglandinas  esteroides  péptidos y proteínas. Esteroideas- Solubles en lípidos. No esteroideas- Derivadas de aminoácidos.  aminas- aminoácidos modificados. Ej : adrenalina, NE  péptidos- cadenas cortas de aminoácidos. Ej: OT, ADH  proteicas- proteínas complejas. Ej: GH, PTH  glucoproteínas- Ej: FSH, LH

pág. 13

P3. PRECIPITACION DE PROTEINAS. Referencia [5] i) Punto isoelectronico. Definición: Es el valor de pH en el cual la disolución acuosa de la proteína no tiene carga iónica neta. El punto isoeléctrico de la caseína es 4.7. ii) Cual es la propiedad más importante a tener presente durante la precipitación de una proteína (p.Ej. Caseína) y ejemplo. La propiedad más importante a tener presente durante la precipitación de una proteína es el punto isoelectronico y solubilidad donde se toma en cuenta la influencia de pH. La superficie de la proteína siempre posee una carga eléctrica, que depende del pH, de los electrolitos presentes y del solvente, en particular el agua, y de los puentes de hidrogeno. El punto isoeléctrico, o una configuración dada de las cargas sobre una superficie proteínica, dependen en cierta medida de la naturaleza de los demás iones de la solución. Según las teorías modernas sobre electrolitos, cada ion está rodeado de una “atmosfera” formada por iones y por agua, actuando estas como moléculas dipolares. Las cargas positivas y negativas de la molécula de proteína ataren iones de carga opuesta, formándose una “atmosfera iónica” que ocasiona cierto “enmascaramiento” de las cargas sobre las proteínas. Esto ocasiona el rechazo de otras moléculas proteínicas para concentraciones salinas bajas, lo que facilita la agregación para concentraciones salinas altas. iii) Porque es importante llegar al punto isoeléctrico en la precipitación de la caseína? Es importante llegar a este punto ya que se logra precipitar lo máximo de caseína. P4. Desnaturalización de Proteínas. Definición y proceso. Si se rompen los enlaces intra e interacatenarios, las proteínas sufren varias modificaciones estructurales, superficiales y profundas que depende de la amplitud y del tipo de anomalías producidos. Esta situación constituye la desnaturalización y puede obedecer a varios fenómenos químicos y físicos diferentes: calor, valores extremos de pH, radiación ultravioleta o presión, detergente u otros agentes tenso activos; urea o guanidina, que rompen los puentes de hidrogeno; solventes orgánicos e iones metálicos pesados. - La desnaturalización en el nivel secundario se realiza mediante agentes que destruyen los enlaces de hidrogeno. Pueden ser suficiente la agitación térmica, en cuyo caso la desnaturalización es una especie de fusión intermolecular. Cuando se cocinan huevos, la albumina se desnaturaliza irreversiblemente y la proteína se transforma es una estructura parecida a un ovillo aleatorio. La transición hélice-ovillo es nítida, como la fusión ordinaria, porque es un proceso cooperativo: Cuando se haya roto un enlace de hidrogeno es más fácil romper sus vecinos y todavía mas fácil los vecinos de estos y así sucesivamente. - La desnaturalización se puede producir también químicamente, por medio de un disolvente que forme enlaces hidrogeno más fuertes que los existentes en la hélice y que puede competir con éxito con los grupos NH y CO. - Los ácidos y bases pueden causar desnaturalización por protonacion o desprotonacion de varios grupos. pág. 14

P5. Efecto de los sustituyentes sobre la orientación de la sustitución, en las reacciones de compuestos heterocíclicos. b) sustituyente donador de electrones en posición 3. Sustituyente donador de e- en posición 3

Los sustituyentes de este tipo dirigen al electrolito bastante a la posición 2 adyacente, debido a la menor energía de los intermediarios de esta ruta: i. Reactividad intrínseca.

La estabilidad de los intermediarios.

pág. 15

d. Conclusiones   

Se extrajo la caseína de la leche, la cual tiene un rendimiento del 19,9% cercano al porcentaje de proteína y carbohidratos que ay en la leche “gloria súper light”. Se hidrolizo la caseína obteniendo una solución amarillo oscura transparente. Se realiza la cromatografía de la caseína, obteniendo que está compuesta por aminoácidos como la glicina, lisina, cistina y propina.

e. Referencia Bibliográfica [1]Dean John , “ Lange Manual de Química ” , Mc-Graw Hill, México 1990,13va .Pág: 120-125. [2]Pavia, D., G Lampman y G. Kris, Quimica Orgánica Experimental, Ed. Universitaria de Barcelona. 1978. Pág: 392, 393 [3] Métodos de extracción de caseína a partir de leche y caseinatos y producción de productos novedosos. Copia adjuntada al informe. [4] Rojanhn C. Productos Quimicos y framauceuticos , vol II , Ed atlante S.A, México1946. Pág.:507. [5] Ducan J. Shaw, Introducción a la química de superficies y coloides, editorial alhambra, S.A, Madrid España 1970. pag. 175. [6] B. Jirgensons, Compendio de Química Coloidal, editorial Continental, S.A., Mexico, pag, 482, 483.

pág. 16

f. Anexos Anexo 1

La cantidad de carbohidratos más la de proteínas, que ay en la leche, suman un 18 %

pág. 17

Anexo 2

Papel cromatografico experimental

pág. 18...