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FGM03: Transporte de sustancias dentro de los organismos vivos Jueves 15 de marzo 7:00-9:30 am Dra. Mariela Arias Objetivo general: Resolver problemas de transporte en los organismos vivientes que incluyan: conceptos de difusión simple y facilitada, ósmosis, transporte activo: primario, secundario y terciario, mecanismos de regulación del volumen celular; así como los sistemas de transporte masivo: endocitosis, exocitosis, arrastre por solvente y transporte transepitelial. (Clase basada en Capítulo 5, Boron).

Transporte de Sustancias Importancia del estudio de los transportadores Aproximadamente un 4,3% del genoma humano (826 genes) está asociado a la codificación de proteínas encargadas del transporte a través de las membranas celulares; estos incluyen los del tipo SLC (Solute carriers), canales iónicos, receptores ionotrópicos, transportadores ABC y los ATPasa. Hay literatura que dice que puede ser hasta el 10% del genoma humano que está asociado con transportadores. En la clínica se reportan múltiples enfermedades relacionadas mutaciones en algunos de estos genes. Por lo tanto, se le ha dado auge a la investigación y preparación de fármacos que utilicen estos mecanismos como medio de inducción a la célula y además como tratamientos directos (o blancos) contra las enfermedades. Membrana celular Se describe como una bicapa de lipídica cuyos componentes principales son las proteínas, los fosfolípidos y el colesterol. Al igual, cuenta con carbohidratos y glicolípidos que en conjunto con los demás componentes conforman lo que se conoce como “modelo del mosaico fluido” y se comporta como una barrera semipermeable. La membrana tiene un grosor aproximado de 4nm. Las proteínas pueden ser integrales o periféricas y funcionan como transportadores de diferentes sustancias. Figura 1: Clasificación de mecanismos Clasificación de mecanismos de transporte de solutos. de transporte De acuerdo con el requerimiento energético se clasifican en a) Pasivos: utilizan energía del gradiente EQ Esta energía proviene del movimiento Browniano, el movimiento de las moléculas que produce el choque entre ellas.  Difusión Simple  Difusión Facilitada b) Activos: utilizan ATP como fuente de energía  Transportadores activos primarios  Transportadores activos secundarios: generalmente se mueve una molécula a favor del gradiente EQ y otra en contra. La primera provee la energía para el movimiento de la segunda.

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FGM03: Transporte de sustancias dentro de los organismos vivos Transporte Pasivo Transporte Pasivo No Mediado: Difusión Simple Es el proceso mediante el cual las moléculas se desplazan a favor del gradiente electroquímico, utilizando la energía cinética de los movimientos moleculares. Es decir, se da un movimiento de soluto de mayor a menor concentración. Esto no significa que no ocurra movimiento del soluto en contra de gradiente, sino que ocurre más a favor de gradiente, por lo que el flujo neto es a favor de gradiente. Factores que influyen a) “Constantes” en el cuerpo humano 

Temperatura: directamente proporcional, un aumento de temperatura implica un aumento en la energía interna de las partículas, permitiendo que la difusión se de con mayor rapidez.



Viscosidad del medio: a mayor viscosidad, mayor dificultad para que el soluto se difunda



Distancia: inversamente proporcional

Figura 2: Flujo neto de un soluto a través de una membrana semipermeable.

b) Variables 

Tamaño molecular: inversamente proporcional, entre más pequeño el soluto, mayor facilidad para que este difunda



Naturaleza química de la molécula: moléculas hidrofóbicas presentan mayor facilidad para difundir a través de la membrana



Composición de la membrana

El paso de las moléculas a través de la membrana depende de las particularidades de esta membrana y aquellas de la molécula. Una bicapa lipídica sintética está compuesta únicamente por lípidos, no tiene colesterol ni proteínas.  Los gases y las hormonas esteroideas son capaces de atravesar la membrana libremente  Pequeñas moléculas polares sin carga son capaces de atravesarla en una menor medida  Grandes moléculas polares sin carga son capaces de atravesarla aún menos  Los iones no pueden atravesar dicha bicapa Esta figura aplica para las bicapas lipídicas sintéticas, pero no es 100% real en las membranas biológicas debido a que estas sí contienen colesterol y proteínas. Las proteínas son las que Permeabilidad de permiten que la permeabilidad de dichos solutos no sea los que Figura 3: presenta dicha bicapa sintética, debido a que funcionan como diferentes solutos en una bicapa lipídica sintética transportadores.

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FGM03: Transporte de sustancias dentro de los organismos vivos Permeabilidad del CO2 En la figura 4 se muestra el efecto del porcentaje de colesterol de una membrana en la permeabilidad de esta al dióxido de carbono.  Una permeabilidad de 0,001 es muy baja e incompatible con las necesidades fisiológicas de una célula  Una permeabilidad mayor o igual a 0,1 no limita la difusión del dióxido de carbono, este pasa libremente  Los puntos negros representan a las bicapas sintéticas  Los puntos rojos representan a las membranas Figura 4: Efecto del % de colesterol de la celulares membrana en la permeabilidad del CO2  El gráfico muestra que al aumentar el % de colesterol en la membrana celular, la permeabilidad del dióxido de carbono disminuye. Esto también ocurre con la permeabilidad de otras moléculas Dicho efecto se presenta intercelularmente debido a que los diferentes tipos de células presentan una diferente composición de la membrana celular y por lo tanto diferencias en el % de colesterol. Cardiomiocito  Alta producción CO2, debido a un alto consumo de O2 (produce CO2 por respiración aeróbica)  Alta permeabilidad CO2  Bajo % de colesterol en la membrana (20%)  No presenta proteínas que faciliten transporte de CO2  Por lo tanto, alta permeabilidad se debe a bajo % colesterol Membrana apical Colonocito  Lumen con alta PCO2 (100)  Por otro lado, en la membrana del capilar se tiene una PCO2 de 40, por lo que gradiente es bastante alto y favorece el paso del CO2 a través de la membrana del colonocito  Alto % colesterol en la membrana (70%)  Función de barrera: al verse favorecida la difusión del CO2 a través de la membrana del colonocito, el alto % de colesterol limita esta difusión como mecanismo de protección, debido a que una alta concentración de CO2 en el interior del colonocito es perjudicial Figura 5: Difusión de CO2 en colonocito Eritrocito  Alta permeabilidad CO2  Alto % colesterol en la membrana (45%): protección ante deformaciones mecánicas durante paso por capilares  Presencia de proteínas (AQP1, RhAg): permiten difusión *intercambio gaseoso*

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FGM03: Transporte de sustancias dentro de los organismos vivos La difusión se puede dar tanto dentro del LEC o LIC como a través de membranas, y para calcular su valor se puede utilizar la Ley de Fick, que se describe de la siguiente manera:

Jx (mol/cm² . s) = Px ([X]o– [X]i) O2: 1,8 cm2/s Glucosa: 0,6 cm2/s Jx =flujo neto (tasa de difusión) Px =coeficiente de permeabilidad [X]o – [X]i = diferencia de concentraciones del soluto (gradiente de concentración)

El coeficiente de permeabilidad (Px) es una medida de que tan fácil se disuelve un soluto en líquidos y toma en cuenta los siguientes factores  El coeficiente de partición (liposolubilidad del soluto):



Coeficiente de difusión del soluto (D): Tamaño molecular (r), temperatura (T), energía térmica de la molécula (K), viscosidad del medio (η):



Grosor de la membrana (Δx) y área (A): a mayor área mayor tasa de difusión y si la membrana es muy gruesa entonces menor la tasa de difusión

Transporte Pasivo Mediado: Difusión Facilitada Proteínas integrales de membrana en su conformación cuaternaria por las cuales pasan los solutos. Poseen sitios de interacción con los solutos. Poros  Proteínas integrales de membrana que poseen un “hueco”  Generalmente están abiertos  Su permeabilidad puede ser modificada, pero no tienen gating como tal  No se puede saturar Canales  Es un poro regulado  Abiertos de manera intermitente, hacia AMBOS lados de la membrana  Poseen compuertas que permiten gating  Cambios de conformación: abierto- cerrado- inactivo (presente en algunos canales) 4

FGM03: Transporte de sustancias dentro de los organismos vivos Transportadores  NUNCA están abiertos hacia ambos lados de la membrana  Complejos, interactúan con solutos  Sufren cambios conformacionales que permiten interacción soluto-transportador, los envuelve debido a que no se da paso directo entre el LEC-LIC  Dicho ciclo permite una diferente interacción con el soluto en cada conformación de la proteína  Superfamilia SLC: 52 familias  Incluye todos los transportadores excepto las acuaporinas, canales iónicos, bombas y Figura 6: Ciclo de cambios conformacionales de un canales ABC transportador  En una misma familia pueden existir diferencias en mecanismo de transporte (difusión facilitada, transporte activo, cotransportadores, etc , en cinética (afinidad y especificidad), mecanismos de regulación (fosforilación), localización en la célula, tejido en que se expresan y cuándo se expresan en el desarrollo. Hay de tres tipos 1. Uniporte: transporte de una sustancia 2. Cotransporte o simporte: transporte de dos o más sustancias en la misma dirección 3. Antiporte o intercambiador: transporte de dos o más sustancias en dirección opuesta Es importante recalcar que los únicos transportadores que son pasivos son los de tipo uniporte, debido a que los antiporte y simporte actúan como transporte activo secundario. En la difusión simple únicamente se depende del gradiente de concentración. Por otro lado, la Figura 7: Efecto de la concentración de soluto (X) difusión facilitada depende de las proteínas que en la tasa de difusión utiliza para transportar el soluto. Las proteínas son saturables, es decir que se llega a un tope máximo de transporte, llamado el Jmax o flujo máximo. La Km es la concentración de soluto a la mitad del Jmax. A menor Km se tiene una mayor afinidad aparente del transportador por este soluto. Implica una Jmax menor, se transportan cantidades pequeñas del soluto. Cuadro 1: Comparación de las propiedades de los poros, canales y transportadores

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FGM03: Transporte de sustancias dentro de los organismos vivos Se pueden tener acarreadores que funcionan en ciertas circunstancias como canales, por ejemplo los SGLTs (Transportador de Sodio y glucosa). En algunas ocasiones se ha visto que estos canales SGLTs actúan como canales para agua y urea. Por otro lado, los canales por todas las interacciones que tienen con los iones que pasan a través de ellos, puede ser que se saturaran. Y por último se ha visto que los canales y transportadores se juntan y hacen complejos macromoleculares canales/transportadores “Channsporters”, por ejemplo el SMIT. a) Poros Aquaporinas        

Poros transportadores de agua Requiere de gradiente osmótico + presión osmótica 6 DTM Zona NPA dominio: regula selectividad poro 4 acuaporinas se unen para formar homotetrámero (ej: 4AQP1) Cada aquaporina tiene su propio poro y se forma un poro central entre ellos Por lo tanto, en un homotetrámero de acuaporina se tienen 5 poros El paso de agua se da en el poro de cada acuaporina, mientras que el poro central permite el paso de moléculas de otro tipo (ej: poro central AQP1: CO2)

Existen 13 acuaporinas descritas en mamíferos, algunas constitutivas y otras reguladas  AQP 0,1,2,4,5: facilitan difusión agua  AQP 11,12: intracelulares, difusión agua  AQP 3,7,9,10: gliceroporinas, permiten paso otras moléculas como glicerol, CO2, amonio, NO, H2O2  AQP1: consitutiva  AQP 2: regulada

Figura 8: Estructura de las acuaporinas

Mecanismos de regulación  Transcripcional  Conformacional (PKC AQP1)  Translocación (PKA AQP2, PKC AQP4 + AQP0): se “guardan” en vesículas, que se translocan a la membrana cuando es necesario Acuaporina 1 (AQP1): está formada por un tetrámero (4 subunidades) de 6 dominios TM más un Figura 9: Mecanismo de regulación de la AQP2 asa B y un asa E que no atraviesan la membrana. Cada uno de los monómeros tiene 28kD de peso molecular (269 aminoácidos. Su poro mide 2.8 Å, la misma medida que el agua, e interacciona con dicha molécula mediante enlaces de hidrógeno. Se encuentra en eritrocitos, riñón, plexos coroideos. Acuaporina 2 (AQP2) se ubica principalmente en el borde apical del epitelio del túbulo colector y es regulada por la ADH. El receptor de ADH, ligado a proteínas Gs, estimula a la Adenilato Ciclasa, la cual activa al AMPc que se una a las PKA, quienes fosforilan a la AQP2 y aumentan la translocación de la vesícula al borde apical. Esto permite que el agua ingrese a la célula y sea expulsada del lado 6

FGM03: Transporte de sustancias dentro de los organismos vivos basolateral por medio de otras acuaporinas como la AQP3 y AQP4. También se fosforilan los genes que regulan la síntesis de las AQP2 y aumenta su producción. Como se muestra en la figura 10, las acuaporinas se expresan en todo el cuerpo, debido a que es una proteína que permite el paso de agua y colabora en la regulación del volumen celular. Por lo tanto, todas las células de los sistemas tienen algún tipo de acuaporina. b) Canales Se pueden clasificar en cuatro tipos 1. Voltaje dependientes 2. Ligando dependientes 3. Operados por segundos mensajeros 4. Mecanosensibles

Figura 10: Tipos de acuaporinas diferentes órganos y sistemas

en los

Cuadro 2: Tipos de GLUT

c) Transportadores Pasivos Glut SLC2  Existen 14 diferentes, son selectivos y uniportadores  12 DTM, de los cuales  7,8,11: forman el conducto  Extremos amino y carboxilo terminal interior célula Transportadores de Urea SLC14  Baja afinidad por urea, velocidad de transporte es baja, por lo que no se saturan tan fácilmente  La urea es una molécula pequeña (radio 2 Å), muy polar, baja solubilidad en lípidos y baja permeabilidad en bicapa lipídica  UTA: específico, UTA 1-4 riñón, UTA 1 y 3 reguladas por ADH, contribuyen al mecanismo de concentración urinaria. Relacionados con mecanismo AQP2. UT-A1 túbulo colector medular nefrona, UT-A2 se ubican en DDAH (delgada descendente asa de Henle) y túbulo colector médula interna  UTB: transporta análogos de agua, amonio y urea. UT-B1 en riñon, eritrocito. Transporta urea y agua. Los UT-B1: ubicados en glóbulos rojos, corresponden con el Antígeno Kidd (grupos sanguíneos).  Altamente reguladas por fosforilaciones o glucosilaciones

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FGM03: Transporte de sustancias dentro de los organismos vivos Transporte Activo Alguna de las moléculas transportadas se mueve en contra del gradiente electroquímico y por lo tanto requiere de energía proveniente de ATP (transporte activo primario o “bombas”) o por medio del gradiente de concentración creado por el primario (transporte activo secundario). Transporte Activo Primario ATPasas (Bombas)  P ATPasas: E1 abierto al LIC E2 abierto al LEC, forman intermediarios fosforilados estables que se pueden aislar o Na+/K+ ATPasa o H+/K+ ATPasa (células parietales estómago) o Ca+2 ATPasas (PMCA: membrana y SERCA: RE)  F ATPasas mitocondrias (F1-F0)  V ATPasas (vacuolares): H+ ATPasas  Transportadores activos primarios tipo ABC (ATP binding cassette) P ATPasas Bomba de Na+/K+ Hidroliza el ATP para transportar (como antiporte) 3 Na+ hacia el exterior de la célula y 2 K+ hacia el interior en contra del gradiente EQ de cada uno. Es una P ATPasa que es electrogénica y ubicua (está en todas partes). Está conformada por tres subunidades: 1 alfa (α) que es donde está el sitio catalítico, donde se hidroliza el ATP y fosforila también al transportador, también es la subunidad más grande. 1 beta (β), que regula la afinidad por los iones, 1 gamma (γ). La subunidad α, Figura 11: Estructura de la Na+/K+ ATPasa incluye 4 isoformas; La Subunidad β tiene 3 isoformas y la γ 7 isoformas.  La subunidad α: 10 DTM, sitio catalítico (actividad ATPasa), tiene 4 isoformas. 3 sitios de unión, uno para el Na+, otro para el K+ y otro para la ouabaína. Se regula por fosforilación.  La subunidad β tiene 3 isoformas y regula el ensamblaje de la bomba en una dirección adeducada. Funciona como sitio de inserción de la subunidad α a las membranas basolaterales de las células, lo que le permite una polaridad en el epitelio (contribuye en la rápida absorción de Na+); se encarga también de regular la afinidad por los iones.  La Subunidad γ tiene 7 isoformas y modula la afinidad por K+, Na+ y ATP. Al fosforilarse por medio de PKA o PKC activa a la bomba. En corazón se llama FXYD (fosfolehman). Usualmente está inhibiendo la actividad de la bomba. Regula por medio de doble inhibición, debido a que PKA o PKC inhiben esta subunidad (si se inhibe al inhibidor se activa la bomba).

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Figura 12: Ciclo Enzimático de la Na+/K+ ATPasa

Funciones  Su función principal es generar el Em reposo  Mantiene concentraciones del LEC y LIC de Na+y K+  Regulación del volumen celular contrarrestando el efecto de Gibbs – Donnan  Mantener el equilibrio osmótico Regulación La regulación se puede dar por cambios en su actividad, por su distribución en la membrana Figura 13: Estructura de la bomba Na+K+ ATPasa 9

FGM03: Transporte de sustancias dentro de los organismos vivos celular, cuántas bombas haya y si se sintetiza más o no (por ejemplo hormonas tiroideas hace que haya más). La subunidad alfa se puede fosforilar por diferentes quinasas como PKC o PI3K, la ERK 1/ 2 MAPK, y esto promueve translocación de subunidad α al sarcolema del músculo esquelético aumentando la actividad de la bomba. Aparentemente ese es el mecanismo de la insulina, la insulina activa la bomba. H+K+ATPasa    



Células parietales de glándulas gástricas, riñón, intestino 2H+ que salen, 2K+ entran por cada ATP que se hidroliza; es electroneutra. Dos subunidades similares a las de la bomba Na+/K+ATPasa La principal subunidad que posee actividad catalítica y sitio de unión de iones es la α y tiene una subunidad B más pequeña. Se inhibe por omeprazole que es un medicamento contra la hiperacidez gástrica. Figura 14: Bomba H+K+ ATPasa en glándulas gastricas

Ca2+ATPasas PMCA: membrana plasmática, saca 1 Ca2+ y mete 1H+  4 isoformas  1 + 4: mayoría tejidos  2: cerebro, músculo estriado, glándula mamaria (responsable contenido Ca2+ leche)  Transcripción depende de [Ca2+]i (menor concentración en célula en reposo aumenta actividad PMCA)  Cuando hay calmodulina y se pegan en el C-terminal, su afinidad por el calcio aumenta (disminuye su Km). También cuando se le pegan en el asa (entre TM2 y TM3) fosfolípidos acídicos aumenta la afinidad por el calcio.  Tiene 10 DTM con ambos extremos intracelulares, con una gran asa en T2-T3 intracelular (dominio transductor). En este dominio se le pueden unir algunos fosfolípidos (la activan) y ahí también se une el dominio que liga la calmodulina (efecto autoinhibitorio).  El dominio catalítico corresponde a la asa entre TM4 y TM5. Aquí es donde se hidroliza el ATP aunque también se le puede pegar el dominio que liga Calmodulina que y así se inhibe la bomba.  El extremo carboxilo terminal es donde se le pega la calmodulina que al unirse disminuye su Km (aumenta afinidad por calcio). También se unen fosfolípidos acídicos como se mencionó anteriormente. También es un dominio autoinhibitorio por que se une a las asas citosólicas y así inhibe la bomba. Posee además sitios de fosforilación PKA y PKC (el efecto de la fosforilación varia en distintas isoformas). Además, es blanco de proteasas calcio dependientes como calpaína (activa la bomba de forma permanente) y calpasas.  También ese carboxilo terminal interactúa con dominios PDZ de otras proteínas que tiene que ver con la dimerización de la bomba que también la activa.  La PMCA es 10 vec...