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Cours de chimie L2 sur la fluorescence ...

Description

Spectroscopie de fluorescence !

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Diagramme simplifié de Perrin-Jablonski!

-> Un état triplet s’observe lorsqu'un électron est excité et occupe une orbitale de niveau d’énergie plus élevé qu'à son état fondamental et si le spin de cet électron change de sens, il forme, avec l'électron auquel il était apparié, un système de deux électrons célibataires aux spins parallèles.! -> Une telle configuration survient à partir d'un état singulet à la suite d’une conversion intersystème, et intervient dans le phénomène de phosphorescence.!

Déplacement de Stokes -> Une partie de l’énergie absorbée peut être émise sous forme de rayonnement : λex < λem! -> Le déplacement de Stokes est l’écart entre la position du maximum de la bande! d’absorption et celle du maximum du spectre de fluorescence! !

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Absorption : loi de Beer-Lambert -> L’efficacité avec laquelle la lumière est absorbée à une longueur d’onde λ par un milieu absorbant est caractérisée par l’absorbance.! -> L’absorbance d’un échantillon suit la loi de Beer-Lambert:!

! Ce qui se simplifie en : ! ! Avec le rendement quantique: ! -> Soit une relation linéaire entre C, la concentration et If l’intensité de fluorescence!

Démonstration de!

Ia = o – I et A = log Io/I = ε.C.l! Sachant que ln = 2,3.log on a donc ln Io/I= 2,3.ε.C.l! Soit Io/I = exp( 2,3 . ε. C. l)! càd I = Io exp ( -2,3 . ε. C. l)! Ia = Io – I = Io – Io exp ( -2,3 . ε. C. l) = Io (1 - exp ( -2,3 . ε. C. l))! Or on sait par approximation que 1 – exp(-x) = 1 – (1 - x) = x! Donc Ia = Io ( 2,3 . ε. C. l)! Comme le rendement quantique φ = If/Ia! On a donc If ! !

Durée de vie fluorescence : 𝞃 -> La cinquième caractéristique importante d’une molécule fluorescente est le temps de déclin, ou durée de vie de fluorescence, τf (tau).! -> Elle correspond à la durée de vie moyenne de l’état excité.! -> La plupart des fluorochromes ont des durées de vie de l’ordre de la nanoseconde.! -> Plus ce temps sera court, meilleur sera la sensitivité du fluorochrome. En effet, plusieurs excitations successives seront possibles car il repassera rapidement dans son état fondamental.!

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Les fluorochromes en biologie -Principalement trois familles de marqueurs fluorescent : ! 1- Les molécules organiques: colorants, les sondes fluorescentes.! 2- Les protéines auto-fluorscentes: GFP et ses dérivés.! 3- Les nano-cristaux semi-conducteurs: quantum dots!

Les fluorochromes intrinsèques -> Les protéines à travers les résidus aromatiques (Phe, Tyr, Trp)!

Les fluorochromes extrinsèques covalents -> Couplages variés avec des protéines ou autre molécules contenant de groupement actifs!

λexc = 540 nm, λem = 567 nm

λexc = 495 nm, λem = 516 nm

λexc = 330 nm, λem = 510 nm

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Représentation schématique des différents facteurs environnementaux susceptibles d’influencer la fluorescence!

Deux types de quenching (inhibition) : !

• Quenching dynamique. Cinétique de Stern-volmer -> Le fluorophore à l’état excité est désactivé suite à un contact avec une autre molécule « quencheur ». ! -> Lors des collisions intermoléculaires, l’énergie électronique sera! convertie en énergie cinétique et de vibrations.!

kM est la somme de toutes les constantes de vitesse de ces processus! τ0 est la durée de vie de l’état excité! kq est la constante de vitesse du processus bimoléculaire!

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-> Plus la pente est élevé, plus le phénomène de quenching est élevé! -> Moins F grand ligand induit changement conformationel dans la protéine ! -> Fluorophore exposé => quencher choc => quenching statique!

Relation de Stern-Volmer Equation de Stern-Volmer

Fo/F = 1 + KSV [Q]

• Quenching statique -> Phénomène observé lors de la formation des complexes non fluorescent ! M + Q MQ! La constante de la stabilité du complexe:! KS = [MQ] /[M][Q]! La conservation de la matière implique:! [M]0 = [M] + [MQ]! La fraction de fluorophores non complexés :! [M]/[M]0 = 1/ (1 + KS[Q])!

On considère que les intensités de! fluorescence sont proportionnelles! aux concentrations (seulement! pour les solutions diluées) :! I0/I = 1 + KS[Q]!

Le rapport I0/I est proportionnel au τ0/τ.! -> La durée de vie de l’état excité des fluorophores M non complexés est! inchangée contrairement au cas de l’inhibition dynamique.!

Inhibitions dynamique et statique simultanées -> L’inhibition dynamique et l’inhibition statique peuvent avoir lieu simultanément. Il en résulte une déviation par rapport à la linéarités des variations I0/I en fonction de [Q].! I0/I = (1 + KSV[Q])(1 + KS[Q]) = 1 + (KSV + KS)[Q] + KSVKS[Q]2

NA est le nombre d’Avogadro.! Vq est le volume qui entoure le fluorophore M! Différences entre quenching statique et quenching dynamique Relation de Stern Volmer : Ф0/Ф = I0/I = 1 + kq τ0 [Q] = 1 + KSV [Q]! • Quenching « Statique » : c’est un quenching SANS diffusion où la distance entre le! donneur et le quencheur est fixe et il y a formation d’un complexe non fluorescent à! l’état fondamental.! -> Ce processus se manifeste lorsque l’inhibiteur est localisé au! voisinage immédiat du chromophore excité. ! -> C’est une interaction quasi-instantanée, trop rapide (kq supérieur à 1010 M-1.s-1) . ! ->Immédiatement après absorption de lumière, le complexe relaxe de manière non radiative vers l’état fondamental. ! -> La diminution de la fluorescence correspond à une diminution de la concentration en molécules fluorescentes. ! -> Ce processus provoque une diminution du rendement quantique sans affecter la durée du vie de l’état fluorescent avec quencher.! Relation de Stern Volmer : Ф0/Ф = I0/I = 1 + kq τ0 [Q] = 1 + KSV [Q]! • Quenching « dynamique » : c’est un quenching AVEC diffusion élastique , il résulte! d’une interaction bimoléculaire contrôlée par la diffusion entre un fluorophore excité! et un inhibiteur. !

-> Le fluorophore retourne à son état fondamental en perdant de! l’énergie au cours de sa collision avec le quencheur. ! -> Le quenching a lieu chaque fois qu’une molécule quencheur diffuse dans la zone de réaction (kq inférieur à 1010 M-1.s-1).! N.B : La constante limite de vitesse de diffusion (pendant un quenching) des molécules! dans un solvant à température ambiante est de : à 1010 M-1.s-1! Si I0/I est linéaire avec la concentration de [Q] , 2 hypothèses : 1 - le quenching est purement « statique»! 2 - ou le quenching est purement « dynamique »! Si I0/I n’est pas linéaire avec la

concentration de [Q], le quenching de fluorescence peut être attribué à des inhibitions dynamique et statique simultanées. ! -> A ce moment, on regarde la première partie de la courbe où I0/I est linéaire avec la concentration de [Q] et on détermine la pente de la droite càd la constante de vitesse du processus bimoléculaire kq .! -> Si la valeur de kq est inférieur à 1010 M-1.s-1 on conclut que le quenching de la fluorescence est initié avec un quenching dynamique et si kq est supérieur à 1010 M-1.s-1 on conclut que le quenching de la fluorescence est initié avec un quenching statique.!

Effet de la température sur Ksv Quenching statique : Ksv diminue quand la température augmente! Quenching dynamique : Ksv augmente quand la température augmente!

! Les ions métalliques

On observe souvent une perte de la fluorescence en présence d’un métal. Des sondes fluorescentes ont été développées pour estimer l’activité de divers ions et déterminer leur affinité (Kd).! !...