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Techniques de fluorescence par Imbert en TLDE au S3...

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La fluorescence TLDE-Imbert Marquage des noyaux des hémocytes d'huître à l'aide d'un fluorochrome ( ou sondes fluorescentes ou fluorophores ). I) Théorie Fluorescence : émission lumineuse provoquée par diverses formes d'excitation autres que la chaleur (on parle parfois de lumière froide). Fluorochrome : Molécule fluorescente possédant la propriété d’absorber de l’énergie lumineuse (excitation) et de la restituer rapidement sous la forme de lumière fluorescente (émission) Diagramme de Jablonski : Une certaine quantité d'énergie lumineuse est nécessaire sous forme de photons à une certaine longueur d'onde. Elle permet de faire passer les électrons d'une couche de base à une couche de niveau supérieur. Ce passage est transitoire puisque les électrons reviennent ensuite à leur niveau de base en restituant l'énergie lumineuse qu'ils ont absorbé à une certaine longueur d'onde = fluorescence. Il y'a donc 3 états : 1- excitation 2-état d'excitation ( 1 à 10 nanosecondes ) 3- émission de fluorescence Chaque transition correspond à un quantum d'énergie : E = H avec : -> h = constante de Planck ->  = fréquence de l'onde lumineuse ➢ l'absorption d'un rayonnement = habsorption ➢ l'émission d'un rayonnement lumineux = hémission Il y a une perte globale d'énergie entre l'absorption et l'émission : h  abs(EX) > h em(EM) Or: h = C/  Donc  = C/ h C : vitesse de la lumière (3X108m.s-1 )  émission >  absorption -> c’est la loi de Stokes L'écart de Stockes : différence entre la longueur d'onde à laquelle on doit exciter/stimuler l'atome et la longueur d'onde à laquelle on mesure la restitution d'énergie lumineuse. Chaque fluorochrome possède son propre spectre. Exemple avec le marquage du noyau avec du DAPI : EX(364 nm)/EM(454 nm) -> la longueur d'onde d'exposition optimale est à 364 nm ( rayons UVs ) -> s'il est exposé à cette longueur d'onde il émettra alors à une longueur d'onde de 454nm ( dans le visible ). II) Mise en pratique Localisation des structures cellulaires : -> marquage au DAPI et à la Phalloïdine-FITc : marquages faits simultanément sur une structure cellulaire permettant de mettre en évidence le noyau avec le DAPI ( forte affinité pour l'ADN ) et l'actine avec la phalloïdine ( la phalloïdine est utilisée pour son affinité avec l'actine et elle couplée avec le FITc qui est fluorescent). Si on expose l'échantillon à une longueur d'onde de 364nm c'est le noyau qui sera observé en fluorescence. Si on expose l'échantillon à une longueur d'onde 488nm c'est l'actine qui sera observée en fluorescence. Activités cellulaires -> Mortalité d'une culture cellulaire ou d'un tissu : l'iodure de propidium ( 535/633nm ) possède une forte affinité pour l'ADN et l'ARN mais ne pénètre que dans les cellules mortes. On peut voir la mortalité des cellules en observant sa fluorescence. -> Activité calcique dans une cellule : utilisation de sondes fluorescentes ayant une forte affinité pour le calcium ( FLUO3-, FLUO4-, etc ) qui émettront une fluorescence proportionnelle au taux de calcium présent dans le cytoplasme de la cellule. -> Phagocytose : utilisation de microsphères fluorescentes -> les cellules qui vont fluorescer sont celles qui auront eu une activité de phagocytose. Plus la cellule fluoresce plus elle a phagocyté. -> Activité enzymatique : intensité de la fluorescence sera proportionnelle à l'activité enzymatique

-> Activités mitochondriales -> Activités lysosomales -> … Marquage de structures cellulaires: Support biologique : cellules fixées ou cellules vivantes : • des cellules en culture (fond en verre) • des cellules fraîchement dissociées, • des coupes de tissus Principales étapes : • Obtention/Prélèvement des cellules • Adhésion des cellules • Fixation : formaldéhyde, paraformaldéhyde… -> permet la conservation des structures cellulaires dans un état figé • Perméabilisation : triton -> permet de faire pénétrer les molécules fluorescentes • Déshydratation : alcool • Marquage : sondes fluorescentes Le système de mesure : microscope à fluorescence (épifluorescence) Microscope inversé : source d'excitation ( lampe au-dessus des cellules ) Caméra/PMT : système d'acquisition Ordinateur : logiciel d'analyse/ de comptage Trajet optique dans le système de mesure : Les filtres et miroirs dichroïques permettent d'exciter et de lire à des spectres d'absorption/émission différentes Lampe Xénon : émet de la lumière à différentes longueurs ( utilisation de filtres )...