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JF GOOSSENS - PU...

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Fluorescence (suite) et Spectrophotométrie atomique

2017-2018

Fluorescence et Spectrophotométrie atomique

– UE8: – Semaine : n°5 (du 02/10/17 au 06/10/17) Date : 09/09/2013

Heure : de 8h00 à 9h00

Binôme : n°64

Professeur : Pr. GOOSSENS Correcteur : n°65

Remarques du professeur : •

Diapo sur Moodle

PLAN DU COURS

Leçon n°1 : suite du cours sur la fluorescence : I)

Spectrofluorimétrie A)

Le dispositif

B)

Les spectres

II)

Les caractéristiques de l'émission

A)

Le déplacement de Stockes

B)

La forme du spectre d'émission

C)

L'intensité du spectre d'émission

III)

Le fluorophore

A)

Les molécules naturelles 1)

Influence des groupements chimiques

2)

Influence du pH et/ou de la polarité du solvant

B)

Les bio-molécules 1) 2)

IV)

Marqueurs fluorescents des protéines : Fluorophores intrinsèques et extrinsèques Marqueurs fluorescents des acides nucléiques

Conclusion sur la fluorescence

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Fluorescence (suite) et Spectrophotométrie atomique

2017-2018

Leçon 1 : suite du cours sur la fluorescence : I)

Spectrofluorimétrie : A)

Le dispositif :

Le spectrofluorimètre a une architecture unique et différente de celle du spectrophotomètre : ○ spectrophotomètre : le détecteur est placé dans la même direction que la source / le monochromateur. Le détecteur visualise l’absorption. ○ spectrofluorimètre : le détecteur est placé perpendiculairement à l’axe source/échantillon ou à 45° Les raisons de la disposition au niveau de l’émission, : –

il faut minimiser les effets d’interférence

–

il ne faut pas que le détecteur soit parasité par la source d’origine

–

il ne faut pas que la lumière source parasite celle de l’échantillon

Schéma simplifié du spectrofluorimètre :

B)

Les spectres :

On obtient deux spectres en fluorescence : ○ on peut tracer un spectre d’excitation : le monochromateur balaye en excitation : ✓ basse longueur d’onde ○ on peut tracer un spectre d’émission : balayer en émission : ✓ haute longueur d’onde

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II)

Fluorescence (suite) et Spectrophotométrie atomique

Les caractéristiques de l’émission :

A)

Le déplacement de Stockes :

Stockes est un anglais du XVIIème. Il montre facilement que l’on a deux longueurs d’onde maximales : ○ une longueur d’onde maximale sur le spectre d’émission ○ et une longueur d’onde maximale sur le spectre d’excitation Le déplacement de Stockes est la différence de longueur d’onde. Un fluorophore a une longueur d’onde précise. Mais comme les spectres de bande de deux chromophores peuvent être superposables, il peut y avoir confusion. Ainsi, le déplacement de Stockes ne peut pas tout à fait caractériser un fluorophore.

exemple : soit deux chromophores distincts A et B : pour une chromophore A : la longueur d’onde maximale du spectre d’émission vaut 200 nm et la longueur d’onde maximale du spectre d’absorption vaut 300 nm → le déplacement de Stockes vaut 100 pour une chromophore B : la longueur d’onde maximale du spectre d’émission vaut 250 nm et la longueur d’onde maximale du spectre d’absorption vaut 350 nm

→ le déplacement de Stockes vaut aussi 100 Donc le déplacement de Stockes, n’est pas assez précis et ne peut caractériser un fluorophore.

B)

La forme du spectre d’émission :

La forme du spectre (forme en cloche) est indépendante de la longueur d’onde d’excitation ou de l’énergie.

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Fluorescence (suite) et Spectrophotométrie atomique Schéma : Le spectre d’émission a environ la même hauteur que le spectre d’excitation. Le plus grand spectre d’émission tracé correspond à la longue d’onde max d’excitation. Si on place le monochromateur sur λ 2, le spectre aura la même forme mais avec diminution sur la valeur de la longueur d’onde de fluorescence maximale.

Les perturbations en fluorescence sont des effets de diffusion nommés effet Raman et effet Rayleigh. ○ attention ! Il ne faut pas qu’il y ait d’interférence avec la diffusion. ○ si le spectre se décale : phénomène de diffusion.

C)

L'intensité du spectre d’émission :

Variation d’intensité de fluorescence : L’intensité (hauteur) du spectre d’émission dépend de : ○ la longueur d’onde d’excitation ○ paramètres physico-chimiques qui influencent la fluorescence : ✓ le pH, la T°, la viscosité et la force ionique. En pharmacologie, on utilise souvent la fluorescence pour remplacer la radioactivité : ○ radioactivité : plus facile car permet détection de faibles concentrations lors de dosage enzymatique MAIS dangereux pour le manipulateur ! Il faut s’assurer qu’il n’y ait pas de phénomènes d’interférences.

III)

Le fluorophore :

A)

1% de molécules naturelles sont des fluorophores :

⟺ 1% des molécules naturelles sont naturellement fluorescentes. Pour être un fluorophore, il faut que la molécule possède ○ des e- π conjugués : molécule cyclique. On retrouve ces e- dans les aromatiques = molécule avec un ou plusieurs aromatiques ○ une certaine rigidité

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Influence des groupements chimiques :

diphényl Le di-phényl est moins fluorescent que le fluorényl (= tri-cycle) car le fluorényl est plus rigide, il n’y a plus de rotation possible. fluorényl

L’ajout d'éléments permet d’augmenter ou de diminuer la fluorescence : ○ pour augmenter la fluorescence : utilisation d’électro-donneurs.

L’aniline (ci-contre) est plus fluo que le benzène.

Fluorescéine

○ pour diminuer la fluorescence : utilisation d'électro-attracteurs.

2)

Influence du pH et/ou de la polarité du solvant :

La quinine (ci-dessus) = principe actif qui permet de traiter le paludisme. Les variations de fluorescence de la quinine dépendent du pH ou de la polarité du solvant.

B)

Fluorophore ajouté aux protéines pour les rendre fluorescentes. (Il s'agit du noyau dansyl).

Les bio-molécules :

Composé non naturellement fluo. Il s’agit des glucides, lipides et acides nucléiques :

1)

Marqueurs de fluorescence des protéines : a- Fluorophores intrinsèques :

En générale, une protéine n’est pas fluorescente. En effet, sur les 22 acides aminés, peu répondent aux bons 5/14

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Fluorescence (suite) et Spectrophotométrie atomique

critères (aromatique cyclique et rigidité). Les seuls qui y répondent sont : ○ le tryptophane (chaîne latérale qui possède un aromatique) ○ la tyrosine (phénol) ○ et la NAD = nicotine amide di-nucléotide = co-facteur souvent présent dans les protéines. Ainsi, une protéine qui a grande proportion de tryptophane et/ou tyrosine et/ou NAD, peut être fluorescente de façon intrinsèque : on parle de fluoration intrinsèque des protéines (0,05%).

b- Fluorophores extrinsèques : Étant donné que les protéines sont très utiles pour comprendre des mécanismes biologiques, il est nécessaire d’utiliser des fluorophores extrinsèques pour rendre les protéines fluorescentes. Les fluorophores extrinsèques sont couplés chimiquement sur une protéine : ○ la fluorescéine (COOH et NH2, liaison peptidique pour être couplé à la protéine) ○ (le noyau dansyl) NB : généralement, cela modifie un peu la protéine. Les glucides ne sont pas fluorescents. Pour les rendre fluo, il faut utiliser des fluorophores extrinsèques. Le lipides possèdent des chaînes carbonées mais non rigides donc ils ne sont pas fluorescents de façon intrinsèque : il faut utiliser des fluorophores extrinsèques pour les rendre fluorescents.

2)

Marqueurs de fluorescence des acides nucléiques :

Les acides nucléiques : = les 4 bases puriques et pyrimidiques (ci-contes) correspondent aux critères de fluorescence : doubles liaisons et relativement rigides. Cependant, ils ne sont pas suffisamment fluo pour les utilisations que l’on en fait. Par exemple, quand on fait du séquençage de l’ADN, on n’utilise pas leur fluorescence car ces composés ne sont pas assez sensibles, pas assez fluo. On a des méthodes plus sensibles : on utilise un fluorophore extrinsèque comme un intercalant = composé qui s’insère dans l’ADN : ○ ce composé qui s’insèrent entre les barreaux de l’échelle d’ADN ○ certains intercalants sont les premiers anti-cancéreux qui sont encore utilisés de nos jours ➜ Sur plan biochimique pour visualiser l’ADN : ○ sous lampe UV : on ne voit pas grand chose ! ○ on ajoute donc du Bromure d’éthidium (le manipulateur doit mettre des gants car c’est un composé dangereux !)

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IV)

Fluorescence (suite) et Spectrophotométrie atomique

Conclusion sur la fluorescence :

1) Localisation subcellulaire de lipides et de protéines 2) Étude dynamique du trafic intracellulaire 3) Étude des interactions moléculaires 4) Étude de la viscosité membranaire (radeau lipidique qui bouge en fonction de la vie de la cellule et se modifie lors d’un processus oncogénique) 5) Étude du repliement d’une protéine ( dénaturation / renaturation) 6) Étude du séquençage de l’ADN 7) Analyse génétique par hybridation in situ FISH

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Fluorescence (suite) et Spectrophotométrie atomique

2017-2018

Leçon n°2 : La spectrophotométrie atomique : I)

Absorption et émission atomique A)

Distinction entre spectrophotométrie atomique et moléculaire

B)

Expérience de Kirchhoff 1)

Absorption d'atomes

2)

Émission d'atomes

II)

L'absorption atomique

III)

Théorie

A)

Principe de la spectrophotométrie d'absorption

B)

Origine de l'absorption 1)

IV)

Loi de Maxwell - Boltzmann

Appareillage

A)

La lampe à cathode creuse

B)

Les dispositifs thermiques pour obtenir des gaz atomiques

V)

Applications

VI)

Conclusion : avantages & inconvénients

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Fluorescence (suite) et Spectrophotométrie atomique

Leçon 2 : La spectrophotométrie atomique : I)

Absorption et émission atomique : A)

Distinction entre spectrophotométrie atomique et moléculaire :

Le spectre de bande correspond à une absorption moléculaire. Le spectre de raie correspond à une absorption atomique. La spectrophotométrie atomique est une technique très utilisée à l’hôpital. Cette technique qui permet de doser des atomes, essentiellement des composés chimiques appartenant à la famille des métaux pouvant être présents à l'état de traces en solution : ○ ppm : unité utilisée pour fluorescence ou absorption ○ ppb : unité utilisée pour la spectrophotométrie d’atome (un microgramme par litre)

○ en rose (absorption) : on est capable de doser 70 métaux ! ○ jaune (émission)

➜ spectrophotométrie d’absorption atomique = SAA : ○ on envoie lumière par rayonnement électromagnétique ○ on observe l’absorption de l’atome, non de la molécule ➜ spectrophotométrie d’émission atomique : ○ photométrie de flamme ○ ou à partir de plasma (gaz porté à haute température, plusieurs milliers de degrés).

B)

Expérience de Kirchhoff : REM dans le visible (400 et 800 nm) : ○ cette lumière blanche passe dans la fente pour focaliser le rayonnement ○ elle passe dans le monochromateur (ici c’est un prisme) ○ on a obtention du spectre de la lumière blanche = un arc en ciel ! youpi :)

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Fluorescence (suite) et Spectrophotométrie atomique Absorption d’atomes :

- lumière blanche - tache blanche = nuage atomique ; la solution a été porté à une haute T° (1000°) pour évaporer le milieu, et les atomes sont atomisés / se trouvé dans un état gazeux - même expérience, on fait passer la lumière blanche par le gaz atomique - on observe un spectre discontinue ; on voit deux raies ou bâtonnets sombres : ○ elles matérialisent une partie de l’absorption par ce gaz ○ on parle de spectre de raie

2)

Émission d’atomes :

- on n’utilise plus de REM mais de la photométrie. On utilise la photométrie de flamme ou bien à partir d’un plasma.- création d’une lampe avec un nuage atomique en chauffant très fortement le gaz : on élève à une T° plus élevée (3000-4000°) - obtention d’un gaz atomique, à l’état excité - ce gaz émet de la lumière qui va passer dans un prisme - on obtient des raies caractéristiques de l’atome = spectre d'émission

II)

L’absorption atomique :

On l’utilise plus que l’émission, à l’hôpital. Cependant émission plus utilisé en recherche. Définition :

- atome à l'état gazeux - transition d'énergie d'un électron non covalent, sur la couche périphérique de l'atome. exemple du sodium (Na) : passage de l'orbitale électronique 3s à 3p (absorption) : raie 589 nm. ○ On envoie un REM. L'atome absorbe et l'e- passe à orbital 3p. L’énergie correspond à une longueur d’onde et la raie d’absorption est de 589 nm. Il y a d’autres transitions plus ou moins stables. Cet atome peut rendre son énergie de façon non photométrique. Le sodium est capable d’absorber et de faire émission (= retour à l’état fondamental sous forme d’une radiation). ○ Chlorure de sodium dans milieu + eau + chauffage. Si l’on jette sel dans la flamme chaude, on observe cette lumière mais c’est dangereux de faire cela.

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Ions généralement dosés par photométrie de flamme : Na, K, Li, Ba et Ca.

III)

Théorie :

A)

Origine et principe de la SAA :

Comment faire pour avoir un gaz atomique : - on a l'échantillon qui peut être liquide ou solide (ou gazeux, rare) - on chauffe à 2000 ou 3000 °K : but : évaporer liquide au sublimer le solide pour obtenir un gaz à l'état atomique - on obtient atomes libres ; il n’y a plus de cohésion - on fait traverser le nuage atomique par un faisceau de lumière (REM) - mesure de l’absorption. On peut faire un balayage dans le domaine spectral 190 - 1000 nm

B)

Origine de l’absorption atomique :

Attention à nos pas trop chauffer son échantillon ! Voici pourquoi :

1)

Loi de Maxwell – Boltzmann : ○ No : nombre atomes état fondamental ○ Ne : nombre atomes état excité ○ g : rapport des poids statistiques des états 0 et e ( nombre entier) ○ ΔE : écart d’énergie entre deux populations des états 0 et e ( en eV; 1 eV= 1,6 10-19 J) ○ k : constante Boltzmann ( 1,38 10- 23 J/K) ○ T° : température en K

○ Rapport entre le nombre d’atome à l’état excité sur L'absorption atomique implique une valeur de le nombre d’atome à l’état fondamental dans le gaz No > Ne. La valeur Ne/No doit être la plus petite possible.

○ Il faut, pour faire de l’absorption, qu’il y est beaucoup d’atomes à l’état excité (No) : grand dénominateur. ○ Il faut fournir de l’énergie en terme de gaz atomique mais pas trop car sinon tous les e- sont à l’état excité.

NB : Dans le cas de l’émission, il faut que Ne soit le plus grand.

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Ne/No est d’autant plus petit que : – –

E est grand la température est basse => Atomes majoritairement à l'état fondamental

Exemples : → Les alcalino-terreux. Le Na et K sont plus étudiés en émission qu’en absorption.

Na : Ne/No = 1.10^-5. Si on fournit plus d’énergie, le rapport augmente. Cela n’est pas favorable. Il faut donc mettre à une basse température pour faire de l’absorption. → Les métaux sont étudiés en absorption atomique. Le Chrome et le Plomb sont utiles à connaître : on dose dans le sang des patients ces métaux pour contrôler leur état de santé. ○ sang des ouvriers soumis à une pollution par les métaux. ○ dans le domaine hospitalier, les anti-cancéreux utilisent des métaux. Le sang des patients doit donc être dosé, pour voir quantité de platine.

IV)

Appareillage :

Le schéma optique d'un appareil d'absorption atomique comporte 4 parties principales :

La source doit traverser le gaz atomique et est différent d’une lampe classique. On utilise une lampe à cathode creuse : ○ ne permet pas de regarder tout le spectre ○ émet les raies de résonance spécifique de l’élément que l’on veut doser : ✓ donc la lampe est spécifique de l’élément que l’on dose. Le dispositif d’atomisation : ○ flamme ou four ○ permet de porter l’élément à doser à l’ état d’atome

A)

La lampe à cathode creuse :

Elle va permettre la production des raies de résonance spécifique de l'élément à doser Il en existe une par éléments (pratiquement). Cela coûte cher ! :o ○ on souhaite doser du fer → on utilise lampe à cathode creuse pour le fer Constitution : pyrex pour pouvoir résister à la température.

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➜lampe à décharge remplie de néon (ou d'argon) ➜la source primaire produit une radiation lumineuse à la longueur d'onde caractéristique de l'élément à doser (raie d'émission) ➜ le courant est envoyé entre l'anode (en zirconium ou en tungstène) et la cathode (constituée de l'élément à doser) ; les e- transitent. ➜Préalablement, au fond d’un creusé métallique, on a déposé l’atome que l’on veut doser. ➜Ne+ frappent le fond de la cathode où se trouve le fer ; le fer est excité : ○ il émet une radiation et retourne à l’état fondamentale La lampe doit donc être choisie de façon adéquate en fonction de notre échantillon. Ce système permet d’avoir une intensité très élevé (intensité qui n’envoie qu’une seule ou deux raies, très sensible, très spécifique, dosage de faible qualité). Il faut un atome pur au fond de la lampe pour que la gamme spectrale soit faible (pas trop large).

B)

Les dispositifs thermiques pour obtenir des gaz atomique Système de chauffage : il faut chauffer l’échantillon pour le mettre sous forme de gaz ○ on utilise un spray ; on met une buse qui contient de l'air, à travers le liquide

La flamme :

○ le nébuliseur rencontre le liquide, les gouttelettes produites traversent le tube, arrivent par dessous et rencontre la flamme (flamme de 10cm de haut pour 1nm de largeur) ○ cette flamme est donc suralimenté par un gaz ○ plus moderne : pas de flamme, pas de nébuliseur ○ quantité précise de l'échantillon solide ou liquide déposé dans une nacelle à l'intérieur

Le four :

○ format avec courant électrique : il chauffe le four par paliers ○ l'enceinte hermétiquement close est chauffée ○ présence d'une sortie pour garantir le refroidissement

Schéma du four :

Carburants pour alimenter la flamme chaude : ○ propane et air ○ si on veut augmenter la T° on met acétylène ou hydrogène ○ si on veut encore plus augmenter la T°, il faut rajouter de l’oxyde nitreux 13/14

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