Histología y Biología celular. Capítulo 2 Técnica histológica PDF

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Técnica histológica. El objeto de estudio de la histología son los tejidos (y las células que los componen). A fin de estudiarlos y comprenderlos, cuenta con dos poderosas herramientas que le permiten observar la microestructura celular y tisular: la microscopía y la técnica histológica.
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Histología y biología celular, 3e

CAPÍTULO 2: Técnica histológica Raquel Guerrero Alquicira; Marcela Rojas Lemus; Teresa I. Fortoul van der Goes

Técnica histológica El objeto de estudio de la histología son los tejidos (y las células que los componen). A fin de estudiarlos y comprenderlos, cuenta con dos poderosas herramientas que le permiten observar la microestructura celular y tisular: la microscopía y la técnica histológica. La técnica histológica es la serie de pasos ordenados que permiten preparar al tejido para su observación a través del microscopio. El tejido se prepara para su observación de acuerdo con el tipo de microscopio que será utilizado. En el caso de la microscopía de campo claro, la técnica más común para preparar las muestras es la técnica histológica ordinaria o de inclusión en parafina. En este proceso, las muestras se infiltran en parafina, con el fin de que tengan la consistencia adecuada para obtener los bloques con las muestras o especímenes. Una vez que se tienen los bloques (inclusión), éstos se cortan en un equipo que se llama micrótomo y con el que se obtienen cortes muy delgados (micrómetros de espesor) lo que permite observar las estructuras celulares y tisulares. Un paso más allá que ofrece la información más detallada corresponde al momento de aplicar la tinción, que da colores a la muestra y gracias a ello es posible identificar diversas estructuras mediante la observación de estas preparaciones con el microscopio de campo claro.

Pasos de la técnica histológica A continuación se describen los pasos y objetivos principales de la técnica histológica ordinaria o de inclusión en parafina. Obtención Estrictamente, este paso no está considerado dentro de la técnica histológica; sin embargo, cualquier muestra a procesar primero debe obtenerse. En esta sección vale la pena hacer mención de algunos conceptos importantes relacionados con la obtención de las muestras: Biopsia. La muestra se obtiene de un individuo vivo. Necropsia. La muestra se obtiene de un cadáver. Biopsia incisional. Se obtiene una sección de la lesión. Biopsia excisional. Es extraída la lesión completa. Tipos de biopsias. De acuerdo con el tipo de tejido que sea necesario obtener, es el tipo de biopsia adecuado. Considere algunos ejemplos: Punción y aspiración con aguja fina (PAAF). Tejidos líquidos como la sangre se obtienen por este método. Punción y aspiración con aguja gruesa (PAAG). La médula ósea roja, al ser un tejido más viscoso que la sangre, se obtiene con una aguja de mayor calibre. Citología exfoliativa. Las células que se pueden desprender de los epitelios (como las de endocérvix y exocérvix), de cavidad oral o de alguna lesión, se obtienen a partir de un raspado o cepillado. Una vez adquirida la muestra que se desea estudiar, de inmediato debe procederse al paso siguiente y que es crucial: la fijación.

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Fijación La importancia de este paso radica en que es el momento en el que se detienen los procesos vitales de las células del tejido obtenido, se evitan los procesos autolíticos y se estabilizan las biomoléculas de la muestra; además, provee un poco de dureza a ésta. Con la fijación se obtiene un elemento clave: se conservan las proteínas de la célula. Sólo si se realiza una fijación adecuada de la muestra los pacientes pueden recibir un diagnóstico preciso y acertado, los proyectos de investigación para observar las diferencias entre los tratamientos serán exactos y toda la información derivada del examen histológico será confiable. La fijación de una muestra puede efectuarse mediante inmersión o perfusión. La inmersión ocurre cuando la muestra se sumerge en el fijador y éste penetra de manera paulatina de la periferia al centro de la muestra, en tanto que la perfusión se propicia cuando el fijador se inyecta al torrente sanguíneo del organismo y, por ende, se distribuye y fija a los tejidos acorde con el flujo de la circulación. En la fijación se emplean sustancias denominadas fijadores; el fijador más utilizado es el formol o formalina al 10 por ciento. A fin de que una muestra se fije de manera adecuada, debe ser embebida en el fijador en pequeños trozos (no mayores a 1 cm3); por cada centímetro cúbico de muestra, se deben colocar 10 cm3 de fijador. El tiempo ideal para que el formol penetre en los tejidos es de 24 a 48 horas. Una vez que la muestra se fija, puede continuarse con el siguiente paso. Deshidratación Una vez que la muestra está fijada, es necesario considerar que las células tienen agua en su interior, debido a que es un componente tisular abundante. Las muestras se deshidratan con alcohol en concentraciones crecientes. El agua abandona de manera paulatina los tejidos y, al final de este paso, el agua ha sido reemplazada con alcohol. Aclaración o difanización El alcohol debe ser reemplazado con un agente aclarante (xileno, tolueno o benceno), debido a que la parafina no es miscible en alcohol, pero sí lo es en los solventes orgánicos como los agentes aclarantes. En este paso, la muestra también adquiere cierta transparencia. Infiltración e inclusión Son dos pasos simultáneos en los que se emplea parafina líquida. La infiltración ocurre cuando la parafina penetra al interior de las células y de las estructuras tisulares; la inclusión alude al momento en que el tejido es embebido en la parafina, para formar un bloque. Co rte o microtomía Una vez que la parafina se ha solidificado y tiene la consistencia adecuada, entonces el tejido está listo para cortarse. Las rebanadas de tejido que se deben obtener para que la muestra permita el paso de la luz del sistema óptico del microscopio deben tener en promedio un espesor de 5-10 micrómetros. Los cortes se obtienen con el micrótomo, que es el instrumento que permite obtener estas rebanadas tan delgadas. Desparafinización Los cortes deben ser desparafinizados, ya que los colorantes no son miscibles en la parafina y sería imposible teñirlos, por lo que es preciso realizar el proceso inverso: se emplean agentes aclarantes para que reemplacen a la parafina. Tales agentes confieren también transparencia al corte. Rehidratación Ahora en el corte los espacios están ocupados por agentes aclarantes, los cuales deben ser reemplazados por alcohol y al final con agua. En este proceso el corte se somete a la rehidratación mediante la inmersión en alcohol en concentración decreciente. Tinció n Los cortes, al ser tan delgados y al haber pasado por el agente aclarante, son totalmente transparentes. A fin de diferenciar estructuras, se tiñen para Downloaded2021995:18PYourIPis154.59.125.5 CAPÍTULO2:Técnicahistológica,RaquelGuerreroAlquicira;MarcelaRojasLemus;TeresaI.FortoulvanderGoes ©2021McGrawHill.AllRightsReserved.TermsofUse•PrivacyPolicy•Notice•Accessibility

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conferirles contraste. Los cortes pueden ser coloreados con tinciones monocrómicas, bicrómicas o tricrómicas. Este apartado se ampliará más adelante. Montaje Una vez que el corte ha sido teñido, debe ser protegido para que se conserve. A cada corte se le coloca resina sintética (transparente) y un cubreobjetos.

Métodos de coloración Existen diversos colorantes y diversas combinaciones de éstos que se emplean para teñir las muestras. De acuerdo con el número de colorantes empleados es factible clasificarlos en monocrómicos, bicrómicos o tricrómicos. A continuación se listan algunos que son empleados con mayor frecuencia.

Tinciones monocrómicas Azul de toluidina. Con esta tinción se observa la muestra en diferentes tonos de azul. Azul del metileno. Con esta tinción se observa la muestra en diferentes tonos de azul.

Tinciones bicrómicas Hematoxilina-eosina. Es la más utilizada —por ello recibe también el nombre de “tinción convencional”— y ayuda a identificar los componentes ácidos (basófilos) y los básicos (acidófilos) de las muestras. Se emplean dos colorantes (hematoxilina y eosina) por lo que también se le conoce como H-E o H y E. La tinción H-E es muy útil porque permite diferenciar entre los dos compartimentos más importantes de la célula: el núcleo y el citoplasma (figura 2-1). En el cuadro 2-1 se describen los componentes tisulares y los colores que exhiben con esta tinción. Fig u r a 2- 1.

En A se observa un corte de la pared de la tráquea, en el que se identifican diferentes tejidos: tejido conjuntivo (▼), adenómeros mucosos (♦), adenómeros serosos (→) y cartílago hialino (*). En B se observa músculo liso. Ambos cortes están teñidos con hematoxilina-eosina (H-E). Fotografías cortesía de Armando Zepeda y Francisco Pasos.

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Cuadro 2-1. Componentes tisulares y los colores que muestran con la tinción hematoxilina y eosina (H-E).

Componente

Ejemplos

Colorante que captan

Color que exhiben

Término

Ácido

DNA, RNA

Hematoxilina

Azulmorado

Basófilo

Básico

Proteínas

Eosina

Rosanaranja

Eosinófilo o acidófilo

Tinciones tricrómicas Masson, Gallego y Gomori. En las tinciones tricrómicas se emplean tres colorantes. Las tinciones tricrómicas utilizadas con mayor frecuencia son: Masson, Gallego y Gomori, las cuales ayudan a diferenciar entre tejidos básicos (epitelial, conjuntivo y muscular) (figura 2-2). El cuadro 2-2 describe las diferencias de coloración de los componentes tisulares. Fig u r a 2- 2.

Se muestran cortes de lengua teñidos con tres tinciones tricrómicas: el corte A está teñido con Masson, el B con Gallego y C con Gomori. Los triángulos (▼) señalan al músculo, las flechas (→) al tejido conjuntivo (colágena) y los asteriscos (*) al epitelio. Fotografías cortesía de Armando Zepeda y Francisco Pasos.

Cuadro 2-2. Tinciones tricrómicas y los colores que exhiben los componentes tisulares.

Componente tisular Tinción

Músculo

Tejido conjuntivo (colágena)

Núcleo

Masson

Rojo

Azul rey

Negro

Gallego

Amarillo

Verde

Rojo

Gomori

Rojo

Verde brillante

Negro

Tinciones selectivas Downloaded2021995:18PYourIPis154.59.125.5 CAPÍTULO2:Técnicahistológica,RaquelGuerreroAlquicira;MarcelaRojasLemus;TeresaI.FortoulvanderGoes ©2021McGrawHill.AllRightsReserved.TermsofUse•PrivacyPolicy•Notice•Accessibility

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Las tinciones selectivas sirven para hacer evidentes biomoléculas específicas en los tejidos o en las células. Carbohidratos. Para demostrar carbohidratos (es decir, mucina o moco, glucocálix y glucógeno) se emplean tinciones como PAS (tinción del ácido peryódico de Schifft) (figura 2-3) o carmín de Best; con estas tinciones dichos componentes adoptan un color rojo carmín (magenta). Fig u r a 2- 3.

En A se muestra un corte de hígado teñido con PAS. Dentro de los hepatocitos se observan las inclusiones de glucógeno en color magenta. En B se observa un corte de la glándula sublingual teñida con mucicarmín de Mayer, en el cual es posible apreciar los adenómeros mucosos en color rosa.

Lípidos. Con la finalidad de demostrar lípidos es preciso emplear tinciones y métodos especiales, ya que durante la técnica histológica ordinaria esta biomolécula se disuelve y, por tanto, lo que se observa es su ausencia, misma que constituye evidencia de lípidos en la muestra. Con tetraóxido de osmio los lípidos adoptan un color oscuro, en tanto que con sudán rojo y rojo oleoso obtienen un color rojo. DNA . Para hacer la diferenciación entre los dos tipos de ácidos nucleicos, ya sea ácido desoxirribonucleico (DNA) o ácido ribonucleico (RNA), se emplea la tinción de Feulgen, misma que colorea de rojo magenta específicamente al DNA (figura 2-4). Fig u r a 2- 4.

Corte de raíz de lirio con tinción de Feulgen, contrastada con verde brillante. El material genético de las células se observa en color magenta.

Proteínas. Hay diferentes tipos de tinciones que se utilizan según se trate de fibras elásticas o reticulares. Fibras elásticas. Las tinciones de Reyes (rosa-magenta), Orceína (morado intenso) y Verchöeff (café oscuro) se emplean para hacer notorio este componente tisular (figura 2-5). Fibras reticulares. La técnica de Wilder (que es una impregnación metálica) sirve para demostrar las fibras reticulares, constituidas por Downloaded2021995:18PYourIPis154.59.125.5 CAPÍTULO2:Técnicahistológica,RaquelGuerreroAlquicira;MarcelaRojasLemus;TeresaI.FortoulvanderGoes ©2021McGrawHill.AllRightsReserved.TermsofUse•PrivacyPolicy•Notice•Accessibility

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colágena III (o reticulina). Mediante esta técnica las fibras se observan en color negro (figura 2-6). Fig u r a 2- 5.

Se muestran cortes de elementos vasculares con tinciones específicas para fibras elásticas (señaladas con el símbolo ▲). Tinción de orceína ( A )), Reyes-Mota (B) y Verchöeff ( C )).

Fig u r a 2- 6.

Corte de bazo con la técnica de Wilder para mostrar fibras reticulares (se observan en negro).

Otros métodos para resaltar componentes específicos Hay, sin embargo, componentes que deben demostrarse con métodos más específicos. Inmunomarcaje. Así, por ejemplo, dentro del gran universo de las proteínas, es factible encontrar un tipo en particular a través del inmunomarcaje, técnica en la que se aprovecha la especificidad antígeno-anticuerpo. Mediante dicha técnica se identifica un antígeno específico por medio de un anticuerpo asociado con un cromógeno (inmunohistoquímica) o con un fluorocromo (inmunofluorescencia). Técnicas argénticas. Las impregnaciones metálicas emplean sales de oro que se adhieren a la superficie de las células, en especial a las del tejido nervioso (figura 2-7). Fig u r a 2- 7.

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Impregnación metálica. A ) Método de Golgi rápido en el que se observa una neurona con sus prolongaciones (fotografía cortesía de la doctora. Laura Colín Barenque). B ) Tinción Kluver-Barrera, aquí se muestra un corte de cerebelo en el que se señala con la flecha (→) la capa molecular de la corteza (sustancia gris) y las fibras que componen a la sustancia blanca (t), que con este método se tiñen de azul intenso.

Tinciones que se utilizan en el tejido nervioso. Debido a su alto componente lipídico, para el tejido nervioso se emplean tinciones especiales, como las de Kluver-Barrera, Nissl o Luxol fast Blue, mismas que colorean a los lípidos sin sacrificar el resto de las características histológicas de la muestra (figura 2-7). Tinciones para microorganismos. A continuación se citan las tres más importantes. Ziehl-Neelsen. Se emplea para identificar a las bacterias ácido alcohol resistentes, como las Mycobacterias (figura 2-8). Brown Brenn para bacterias. Técnica que identifica a las bacterias grampositivas (Gram+), que toman el color azul y las gramnegativas (Gram −) que lucen de color rosa o rojo (figura 2-8). Grocott. Con esta tinción es posible hacer visibles a los hongos y también aPneumocystis carinni e Histoplasma spp. Los tiñe de color negro. Fig u r a 2- 8.

A ) Es posible apreciar micobacterias (rosa magenta) en el tejido pulmonar tras aplicar la tinción Ziehl-Neelsen. B ) Mediante la tinción de Brown Brenn se hacen evidentes las bacterias grampositivas (Gram+) en color azul y las gramnegativas (Gram−) en color rosa. Downloaded2021995:18PYourIPis154.59.125.5 CAPÍTULO2:Técnicahistológica,RaquelGuerreroAlquicira;MarcelaRojasLemus;TeresaI.FortoulvanderGoes ©2021McGrawHill.AllRightsReserved.TermsofUse•PrivacyPolicy•Notice•Accessibility

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Correlación clínica El departamento de Patología de los hospitales procesa las muestras obtenidas de los pacientes; es muy importante que tales muestras se obtengan con el procedimiento correcto, que hayan sido fijadas de manera adecuada e inmediata (lo que constituye trabajo y responsabilidad del médico que realiza el procedimiento), ya que el diagnóstico que emita el patólogo está en función de las características morfológicas que observe al analizar dicha muestra. Por supuesto, sería muy grave que el diagnóstico del paciente resultara ser erróneo debido a una mala fijación o falta de apego al procedimiento bosquejado en este capítulo.

¿Sabias que…?

Aunque el proceso al que se somete la muestra se haga con todo cuidado, siempre existe la posibilidad de que ocurra lo que los histólogos denominan “artefactos o artificios de la preparación”. A menudo sucede que lo primero que identifican los estudiantes son estos “artefactos”. La figura 2-9 muestra algunas imágenes para ilustrar esto e identificarlos. Tales artefactos ocurren por errores en el proceso de la técnica y es factible observar precipitados, dobleces, desgarros, etc. Durante el corte, si la cuchilla está mellada, en el tejido habrá evidencia de ello. Las burbujas que puede formar la resina no son propiamente un artefacto, pero es común que cuando los estudiantes las encuentran piensen que esas son las células. Es labor del docente instruir de manera adecuada a sus alumnos sobre estos artefactos y aclarar las dudas que hacen surgir.

Fig u r a 2- 9.

Artefactos o artificios en las preparaciones histológicas. En A se observa una fractura en el tejido; en B , precipitados; en C , mella dejada por la cuchilla; en D y E , plegamientos; en F , burbujas.

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