Hodowle zawiesinowe. Bioreaktory. PDF

Preview

Summary

Metody kultur in vitro 8. Hodowle zawiesinowe. Bioreaktory. 1. Definicja hodowli zawiesinowych. Podstawowe zasady prowadzenia. Hodowle to hodowle nieuorganizowanych w na a w immobilizowany. Kultura pojedynczych swobodnie zawieszonych w nazywana jest: uzyskiwane w wyniku przeniesienia tkanki kalusowe...

Description

Metody kultur in vitro Wykład 8. Hodowle zawiesinowe. Bioreaktory. 1. Definicja hodowli zawiesinowych. Podstawowe zasady prowadzenia. Hodowle komórkowe – są to hodowle żywych komórek nieuorganizowanych w tkankę rosnące na podłożach płynnych, stałych a także w sposób immobilizowany. Kultura pojedynczych komórek swobodnie zawieszonych w podłożu płynnym nazywana jest: • hodowlą zawiesinową – uzyskiwane w wyniku przeniesienia tkanki kalusowej na podłoże płynne, a do jej założenia wykorzystuje się delikatny, mało zwięzły kalus (twardego kalusa nie uda się wprowadzić do kultury zawiesinowej). W trakcie jej prowadzenia niezbędne jest mieszanie z wykorzystaniem wytrząsarki lub urządzeń zapewniających ruch orbitalny naczynia, a podłoże jest zwykle takie samo jakie wykorzystuje się do hodowli kalusa, ale w postaci płynnej (czasem wymaga drobnych modyfikacji): o podłoże bogate, podobne składem do pożywek stosowanych w hodowli całych roślin; o konieczna jest suplementacja w hormony roślinne. Kalus jest nieorganizowaną, rosnącą masą komórek, który powstaje w wyniku odróżnicowania komórek eksplantatu. Komórki tej tkanki mają cieńsze ściany komórkowe i brak jednego, wyraźnego ośrodka wzrostu. Znajdują się w stadium podstawowym (ang. ground state) i przypominają komórki parenchymatyczne: posiadają duże wakuole oraz mało cytoplazmy. W hodowlach in vitro indukowany jest odpowiednimi stężeniami cytokinin oraz auksyn i często powstaje przypadkiem przy okazji prowadzenia innej hodowli. Kalus może być zwięzły lub luźny i ta właściwość fizyczna ma znaczenie w zależności od celu dalszego wykorzystywania tej tkanki. Tkanka kalusowa tworzy przyrastające komórki, które tworzą kolejne, narastające na siebie warstwy. W trakcie dwutygodniowego wzrostu objętość kalusa zwiększa się dwukrotnie, co jest niezwykle szybkim tempem w świecie roślin. Tkanka ta może być hodowana zarówno na świetle oraz w ciemności i można wyróżnić specyficzne etapy jej rozwoju: • proliferacja – tkanki merystematyczne w zewnętrznych warstwach dzielą się bardzo szybko (1000% wzrost w ciągu tygodnia), co umożliwia gwałtowny wzrost i częste podziały komórek; • różnicowanie: o dochodzi do zmiany aktywności metabolicznej; o rozpoczyna się wzrost komórek oraz formowanie struktur (np. tracheid, czyli cewek); o następuje organogeneza. Komórki tkanki kalusowej charakteryzują się bardzo częstymi mutacjami, dlatego też odchodzi się od przechowywania okazów roślin w bankach tkanek w formie kalusa. Z drugiej strony jest to bardzo dobry materiał do transformacji przy użyciu Agrobacterium tumefaciens. Podłożem dla kalusowych hodowli zawiesinowych może być klasyczna pożywka MS, ale także podłoża specjalnie przeznaczone do hodowli zawiesinowych np. Gamborg lub B5, szczególnie w przypadku roślin jednoliściennych. Bardzo często wykorzystuje się również: • kondycjonowanie pożywek (ang. conditioned medium) – pożywka, w której uprzednio rosła jakaś kultura, co spowodowało jej „oswojenie” i wzbogacenie w metabolity pobudzające rozwój innej, bardziej wymagającej tkanki. Wytrząsanie (mieszanie) hodowli zawiesinowej powoduje rozbicie agregatów komórek na pojedyncze komórki, zapewniając jednolitą ich gęstość w całej objętości hodowli i wspomagając wymianę gazową.

2. Rodzaje hodowli zawiesinowych. Hodowle okresowe – prowadzone w stożkowych kolbach ze znanym inokulum, czyli znaną ilością komórek kalusa (objętością zawiesiny) wprowadzoną do określonej objętości pożywki. Podłoże z hodowlą nie powinno zajmować więcej niż 20%, aby umożliwić wydajny proces wymiany gazowej, a sama kolba powinna być zamknięta w celu zabezpieczenia przed parowaniem. Zamknięcie to nie może być jednak szczelne, ze względu na potrzebną wymianę gazów ze środowiskiem zewnętrznym.

Rysunek 1. Kinetyka wzrostu hodowli okresowej.

Kinetyka wzrostu hodowli ma charakterystyczny przebieg zgodny z krzywą wzrostu komórek. Przy pasażowaniu do nowej pożywki przenosi się małą objętość zawiesiny pojedynczych komórek, a liczba komórek w hodowli podwaja się co około 20-50 godzin. Hodowle okresowe wymagają małego nakładu pracy, który obejmuje wyłącznie założenie oraz likwidację. Wadami tego rodzaju kultury są jednak ciągłe zmiany kinetyki wzrostu, aktywności metabolicznej komórek oraz składu podłoża hodowlanego. Hodowle okresowo-dolewowe – prowadzone są w sposób analogiczny jak hodowle okresowe, jednak w momencie osiągnięcia fazy spowolnionego wzrostu dodawana jest nowa porcja pożywki, co powoduje przedłużenie fazy wzrostu liniowego. Wymagają one więcej czasu i pracy niż hodowle okresowa. Hodowle ciągłe – gdzie w sposób ciągły do hodowli jest dostarczana świeża pożywka, a zużyta jest usuwana, co umożliwia utrzymanie kultury w fazie wzrostu wykładniczego lub liniowego, ale również wymaga więcej czasu i pracy niż hodowla okresowa. Zwykle jest prowadzone są w bioreaktorach na dwa sposoby: • hodowle ciągłe zamknięte – stała, okresowa wymiana tylko podłoża hodowlanego, nie komórek, a hodowla kończy się po osiągnięciu maksymalnej gęstości; • hodowle ciągłe otwarte – stała lub okresowa wymiana zarówno podłoża hodowlanego oraz komórek, a gęstość hodowli utrzymywana jest na stałym poziomie. 3. Bioreaktory: podstawy i problemy w hodowli komórek. Bioreaktor – to urządzenie wykorzystywane do prowadzenia hodowli okresowych lub ciągłych, gdzie zawiesina komórek jest mieszana mechanicznie przy pomocy mieszadła lub przez napowietrzanie:

mieszalniki mechaniczne charakteryzują się pojemnością do 5000 litrów i jako pierwsze znalazły zastosowanie w produkcji na skalę masową; • mieszanie powietrzem (ang. air-lift) jest możliwe poprzez wtłaczanie do bioreaktora powietrza pod odpowiednim ciśnieniem, a gradient tegoż ciśnienia i gęstości hodowli powoduje ciągły ruch zawiesiny. Bioreaktory mogą mieć różną wielkość, w zależności od ich przeznaczenia i wyróżnia się: laboratoryjne, półprzemysłowe i wielkoskalowe, przy czym bioreaktory w laboratorium często mają charakter zamknięty a hodowla prowadzona jest w warunkach sterylnych. Niezależnie od rodzaju i sposobu prowadzenia hodowli, podczas jej prowadzenia niezbędne jest okresowe szacowanie tempa wzrostu komórek oraz ich żywotności. Określanie tempa wzrostu komórek można określić: • w kulturach tkankowych poprzez: o wielkość (długość korzeni, pędów, powierzchnia liści); o świeżą masę; o suchą masę; • w hodowlach zawiesinowych poprzez: o liczbę komórek na mililitr pożywki (z użyciem hematocytometru lub licznika cząstek); o objętość upakowanych komórek (PCV, ang. packed cell volume) poprzez szacowanie ilości osadu na ilość pożywki; o świeżą masę komórek (filtr Buchnera); o suchą masę komórek: § suszenie przez 12 godzin w 60°C lub 2 godziny w 105°C do uzyskania stałej masy. Oznaczanie żywotności komórek możliwe jest natomiast dzięki wykorzystywaniu specyficznych barwników takich jak dwuoctan fluoresceiny (FDA), który w żywych komórkach jest hydrolizowany do fluoresceiny, Evan’s blue, który jest usuwany z żywych komórek lub błękit metylenowy wnikający tylko do żywych komórek. Celem każdej hodowli bioreaktorowej jest otrzymanie jak największej ilości materiału biologicznego dobrej jakości i aby uzyskać taki efekt należy odpowiednio zoptymalizować warunki panujące w naczyniach hodowlanych. Pierwszym i największym problemem w hodowli komórek w fotobioreaktorach jest niejednakowa ilość światła: • tempo wzrostu komórek (i tym samym przyrost biomasy) w fotobioreaktorze zależy od czasu ekspozycji komórki na światło optymalne oraz procesów fotoinhibicji i fotolimitacji. Podczas hodowli w bioreaktorze o nierównomiernym i niejednolitym natężeniu światła, naświetlane zostają jedynie te komórki, które znajdują się najbliżej zewnętrznych części naczynia hodowlanego. Efekt ten potęguje się wraz z przyrostem biomasy, co powoduje zagęszczenie hodowli i blokowanie przechodzenia promieni słonecznych do wszystkich części pożywki. Jest to proces nazywany: • samozaciemnieniem – zaciemnienie wewnętrznych partii komórek w bioreaktorze przez partie zewnętrzne, które może skutkować inhibicją wzrostu przez fotoinhibicję partii zewnętrznych oraz fotolimitację (niedostateczną ilość światła) partii komórek znajdujących się wewnątrz. W celu uniknięcia tego zjawiska wykorzystuje się specjalnie zaprojektowane szklane, porowate gąbki, dzięki którym komórki hodowane są rozłożone równomiernie w naczyniu hodowlanym, a światło zostaje rozproszone jednolicie we wszystkie miejsca bioreaktora. Jest to jeden z najważniejszych zabiegów usprawniających efektywność hodowli w fotobioreaktorach, ponieważ ilość światła jest pierwszym i jednym z dwóch najważniejszych czynników ograniczających wydajność procesu fotosyntezy. •

Rysunek 2. Samozaciemnianie komórek w bioreaktorze wraz ze wzrostem zagęszczenia hodowli.

Rysunek 3. Zasada działania szklanych gąbek rozpraszających światło.

Drugim głównym czynnikiem ograniczającym proces fotosyntezy i wzrost komórek roślinnych jest stężenie CO21 . Zmiany klimatu spowodowane zwiększeniem stężenia dwutlenku węgla w konsekwencji prowadzące do zwiększenia intensywności fotosyntezy, mogą spowodować gwałtowny przyrost stężenia tlenu atmosferycznego, co może okazać się niekorzystne dla organizmów zasiedlających środowisko lądowe ze względu na większe narażenie na stres oksydacyjny i przyspieszenie starzenia. W bioreaktorach panuje jednak środowisko wodne, w którym dwutlenek węgla rozpuszcza się 100x słabiej niż w powietrzu atmosferycznym. W momencie obniżenia jego stężenia RuBisCO zmienia swoją aktywność z karboksylazy na oksydazę powodując drastyczne spowolnienie fotosyntezy. Dlatego też w komórkach roślinnych jest obecny: • mechanizm zatężania CO2 – pobieranie i przekształcanie dwutlenku węgla w formę jonów wodorowęglanowych przekazywanych i gromadzonych następnie w karboksysomach. Węgiel jest dostępny dla RuBisCO wyłącznie w formie gazowej, dlatego jony HCO3- muszą być do niej przekształcone przez anhydrazę węglową. W momencie deficytu jonów wodorowęglanowych w komórkach roślinnych fotosynteza zostaje zatrzymana przez zahamowanie mechanizmu zatężania CO2. Zdecydowana większość anhydraz (periplazmatycznych i cytoplazmatycznych) odpowiedzialnych za wyłapywanie jonów wodorowęglanowych ze środowiska jest powstaje w sposób indukowany w przeciwieństwie do 1

górną granicą stężenia dwutlenku węgla tolerowaną przez rośliny jest 5%.

tych biorących udział w jego przekształcaniu, które na bieżąco powstają w komórkach. Ich aktywność oraz obecność różnych izoform jest bardzo dobrym wyznacznikiem do określenia, czy roślina rośnie w warunkach dobrej suplementacji węgla (określanie na podstawie badań molekularnych): • 2,5% CO2 = 4,5x wyższa fotosynteza = wyższy wzrost. CO2 tak jak inne gazy lepiej rozpuszcza się w zimnych podłożach, dlatego należy przechowywać wszelkie pożywki w chłodni. Dwutlenek węgla można kupować lub pobierać z filtrów fabryk i przepuszczać przez hodowlę, co jest jednym ze sposobów na usprawnienie hodowli, kolejnym jest: • kondycjonowanie podłoża (CM) – komórki roślinne produkują bardzo dużo metabolitów, które są wydalane do środowiska. Takie pożywki mogą być następnie wykorzystywane do hodowli kolejnych kultur, które w konsekwencji charakteryzują się znacznie większym przyrostem komórek lub tkanek roślin w porównaniu do świeżych pożywek właśnie przez obecność wyżej wymienionych związków (autoindukcja wzrostu). Ma to istotne znaczenie w hodowlach bioreaktorowych, w których zwiększenie przyrostu np. glonów jest ogromne (zyski liczone są w milionach komórek na mililitr). Podłoża kondycjonowane powodują przyrost suchej masy oraz wydajności fotosyntetycznej i tutaj nie są istotne związki mineralne, ale właśnie związki wytworzone przez poprzednią hodowlę: o kondycjonowanie podłoży działa na podobnej zasadzie jak quorum sensing bakterii. Innym sposobem “pomocy” dla hodowli w bioreaktorach jest również indukcja stresu, ponieważ w momencie optymalnych warunków wzrostu komórki roślinne produkują znikomą ilość metabolitów wtórnych, których jednym z głównych zadań jest funkcja ochronna przed różnego rodzaju stresorami. Dlatego też, jeśli dana hodowla jest skierowana na uzyskanie metabolitów wtórnych, które odgrywają duże znaczenie w życiu człowieka, hodowla nie może być prowadzona w warunkach idealnych i musi zostać poddana czynnikom stresowym różnego pochodzenia (abiotycznych, biotycznych, endogennych) np.: • dodatek elicytorów; • dodatek prekursorów produkowanych substancji; • immobilizacja komórek; • adsorpcja metabolitów na wymiennikach jonowych; • traktowanie czynnikami fizykochemicznymi (prąd elektryczny, zmiany pH, ciśnienie, stężenie tlenu, ekstrakcja dwufazowa). Elicytory – czynniki wywołujące odpowiedź stresową rośliny (komórek roślinnych) różnego pochodzenia: • biotyczne: składniki ścian komórkowych grzybów, bakterii, enzymy czy lipidy; • endogenne: syntetyzowane konstytutywnie w komórkach roślinnych (np. mediatory produkcji fitoaleksyn); • biotyczne: indukcja stresu mechanicznego (kulki szklane) lub chemicznego (metale ciężkie, KCl, promieniowanie UV). 4. Masowe kultury mikroglonów. Kultury masowe glonów – hodowle prowadzone w otwartych w zbiornikach np. basenach budowanych na środku pustych terenów wystawionych na intensywne działanie promieni słonecznych, skutkując ogromnym przyrostem biomasy wykorzystywanej jako biopaliwa, dodatki do żywności czy w kosmetyce. Glony hoduje się głównie do: • produkcji biomasy bogatej w białka, lipidy i cukry; • filtracji;

• tworzenia źródeł do izolacji regulatorów wzrostu; • wytwarzania pasz lub suplementów żywności; • tworzenia źródeł energii odnawialnej; • bioremediacji. Ze względu na obecność wielokrotnego cyklu komórkowego hodowle glonów charakteryzuje bardzo szybkie tempo wzrostu, większe niż w przypadku innych znanych hodowli komórkowych a ich przyrost jest nawet ośmiokrotny w stosunku do tradycyjnych kultur. Najczęściej hodowanym rodzajem są jednokomórkowe lub zebrane w cenobia mikroglony o wielkości od 0,2 do 50 μm. Większość z nich to organizmy eukariotyczne, zawierające wszystkie rodzaje chlorofilu i wykazujące ogromne zróżnicowanie w swojej budowie, funkcji i metabolizmie. Mikroglony są organizmami kosmopolitycznymi (często ekstremofilnymi), należą do bardzo starej linii filogenetycznej i zaliczane jest do tej grupy około 30,000 gatunków. Ich hodowle prowadzone są w bioreaktorach o wysokiej gęstości populacji, a wyprodukowanie biomasy analogicznej jak w uprawach tradycyjnych wymaga 20-krotnie mniej wody.

Rysunek od 4. do 6. Rodzaje glonów najczęściej hodowanych w bioreaktorach: Chlorella, Spirulina oraz Scenedesmus.

5. Cykl komórkowy: przebieg i regulacja. Wielokrotny cykl komórkowy jest ewolucyjnym przystosowaniem glonów do maksymalnego wykorzystywania światła docierającego do środowiska wodnego a jego przebieg jest podobny u większości gatunków i obejmuje: • wzrost w fazie jasnej, magazynowanie substancji cukrowych (czasem powielanie materiału genetycznego); • podziały w fazie ciemnej (korzystanie ze zmagazynowanej energii) dla: o optymalnego wykorzystania zmagazynowanej energii; o replikacji materiału genetycznego oraz podziału mitotycznego i uwolnienia komórek: § brak promieni UV = brak mutacji. Ilość podziałów komórkowych zależy od warunków hodowli: można uzyskać od 2 do 16 komórek potomnych w trakcie cyklu trwającego 24 godziny, a więc w ciągu 2-4 dni występuje przyrost wykładniczy biomasy. Nakładanie się na siebie kolejnych cykli umożliwia produkcję większej ilości komórek a glony w każdym cyklu dzielą się wyłącznie mitotycznie. Mejoza zachodzi bardzo rzadko i tylko w bardzo niekorzystnych warunkach, wskutek czego dochodzi do produkcji gamet oraz zygoty. Aby uzyskać jak najlepszy efekt należy doprowadzić do uzyskania hodowli synchronicznych, w których wszystkie komórki są na dokładnie tym samym etapie cyklu komórkowego: • hodowla na świetle; • co godzinę pobór próby badawczej i umieszczenie jej w ciemności;

sprawdzenie na ile komórek się matka podzieliła: o dzięki temu można zsynchronizować i zmaksymalizować cykl. Kolejnym sposobem zwiększenia wydajności hodowli mikroglonów jest badanie uniwersalnych markerów stresu oksydacyjnego (NO oraz H2O2) w celu usprawnienia elicytacji kultur glonowych, a w konsekwencjach ich wzrostu. W trakcie cyklu proporcje tych cząsteczek się zmieniają, co skutkuje zmiennymi reakcjami fizjologicznymi: • dodanie nadtlenku wodoru na samym początku prowadzenia hodowli nie daje żadnych znaczących efektów; • dodanie nadtlenku wodoru w momencie maksymalnej wydajności fotosyntetycznej powoduje usprawnienie transportu elektronów w chloroplastach, co powoduje przejście dodatkowego cyklu podziałowego w tych samych warunkach hodowli i zwiększony o 50% przyrost autospor; • dodanie nadtlenku wodoru pod koniec maksymalnej wydajności fotosyntetycznej i w momencie przygotowania do podziału zwiększa tempo fotosyntezy, co powoduje zwiększenie biomasy każdej z komórek. •...