Hodowle komórkowe - Opisanie zagadnień na egzamin. PDF

Preview

Summary

Opisanie zagadnień na egzamin. ...

Description

1 Opisz zasadę hodowli masowych w systemie monolayer i podaj dwa przykłady. Złożone specjalne zestawy prostokątnych szalek dostarczające od 600 do 24000 cm2 powierzchni; Butelki typu T75 zwierające dodatkowe przegrody („półki‖ ) umożliwiające adhezję komórek; Dodatkowo w naczyniach umieszcza się półprzepuszczalne błony, na powierzchni których rosną komórki, komórkiodżywiane są przez pożywkę z górnego przedziału, a wydzielają produkty do niższego przedziału poprzez półprzepuszczalne błony; pożywka z zawartymi w niej produktami jest zbierana, a otrzymywany produkt oczyszczany; Szalki hodowlane zawierające półprzepuszczalne błony, przez które przenikają związki produkowane przez rosnące komórki. -Nest R Milti-layer Flasks -BD Falcon TO Cell Culture Multi-Flask

2. Charakterystyka mini-bioreaktorów typu CeLLine. Mini-bioreaktory membranowe CELLine–wysokoskoncentrowana masa komórek zwierzęcych oraz przeciwciał monoklonalnych;  Układ z tzw. ciągłym przepływem, doprowadzającym do hodowli świeże medium odżywcze i równocześnie stale odprowadzający produkty metabolizmu;  Naczynie polistyrenoweo dobrych właściwościach optycznych dające możliwość monitorowania morfologii komórek podczas ich wzrostu;  Wnętrze reaktora podzielone jest na dwie części: odżywczą(1) i hodowlaną(2), przez selektywnie przepuszczalną membranę odżywczą (6); W badaniach przeprowadzonych na zlecenie INTEGRA Bioscienceswykazano, że w pojedynczym bioreaktorze CELLine(CL-1000) można uzyskać ponad 100 mg oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych w czasie ok. 39 dni. Czynności związane z ich otrzymywaniem nie są bardziej skomplikowane niż przy metodzie tradycyjnej (T-flask). Gęstośćhodowli  Komórki mogą by hodowane we wnętrzu przestrzeni hodowlanej do uzyskania bardzo wysokiej gęstości.  W porównaniu z tradycyjnymi metodami hodowli ilość komórek otrzymanych w minibioreaktorzeCELLine(w przeliczeniu na 1 ml) jest dużo wyższa, np. komórki hybrydomai limfocyty namnażane w CELLinemogą osiągnąć gęstość ok. 30-krotnie wyższą niż hodowane tradycyjnymimetodami(tj. T-flask).  Oddzielenie rosnących komórek od medium odżywczego przez półprzepuszczalną membranę pozwala na izolowanie i oczyszczanie produktów komórkowych. Odpowiednio dobrana wielkość porów w membranie odżywczej umożliwia izolację wielu cytokin (np. IL-2 wykazuje aktywność biologiczną tylko w środowisku komórkowym, tj. w przestrzeni hodowlanej), natomiast niektóre cytokiny wydzielnicze mogą osiągnąć wysokie stężenie nie będąc związanymi z hodowlą.

Surowica  Stopień zużycia surowicy jako źródła składników odżywczych może być znacznie ograniczony poprzez dodanie jej bezpośrednio do przestrzeni hodowlanej i jej równoczesnej eliminacji z medium odżywczego -na 1 litr hodowli komórek w CELLinezużywa się wówczas 1 ml surowicy, podczas gdy w statycznej hodowli (np. w T-flask) ok. 100 ml tej substancji.  Są to warunki wystarczające dla wzrostu i prawidłowego rozwoju większości komórek, m.in. hybrydoma.  Niektóre linie komórkowe mogą być bardziej wrażliwe na składniki surowicy i wymagają jej dodania również do płynu odżywczego. Porównanie wydajności hodowli w warunkach z surowicą i bez pozwala na ustalenie optymalnych warunków.  Taka oszczędność nie wpływa w żadnym stopniu na przebieg hodowli. Dodatkową zaletą jest wyeliminowanie interferencji białek surowicy oraz niespecyficznych immunoglobulin podczas oczyszczania wyizolowanych przeciwciał monoklonalnych wyprodukowanych przez komórki. Medium odżywcze  Częstość wymiany medium odżywczego ma wpływ na wyniki hodowli. Dyfuzja medium przez półprzepuszczalną membranę odżywczą jest uwarunkowana gradientem stężeń ustalonym pomiędzy płynem odżywczym i płynem stanowiącym roztwór dla rosnących komórek.  Wraz ze zubażaniem płynu odżywczego siła dyfuzji roztworu również ulega redukcji i następuje spadek masy żywych komórek w przestrzeni hodowlanej. Jest to również związane z akumulacją toksycznych metabolitów.  Medium odżywcze nie zmienia koloru tak intensywnie jak to ma miejsce w hodowli statycznej, z powodu ciągłego natleniania hodowli przez otwory w dnie przestrzeni hodowlanej następuje redukcja kwaśnych metabolitów. Zmiana barwy pożywki może więc być wskaźnikiem aktywności metabolicznej komórek, ale nie pozwala jednoznacznie przesądzać o konieczności wymiany płynu odżywczego.  Medium odżywcze powinno być wymieniane tak często, aby gradient stężeń po obu stronach membrany był jak najwyższy, co gwarantuje maksymalną dyfuzję składników odżywczych do hodowli. Inoculum  Istnieje ścisła zależność pomiędzy gęstością inoculuma początkowym tempem wzrostu komórek.  Przy zbyt niskiej gęstości inoculumkomórki znacznie dłużej adaptują się do wzrostu, później osiągają oczekiwaną gęstość końcową lub też zupełnie tracą zdolność do podziału. Jest to najczęściej właściwość „osobnicza‖ ustabilizowanej linii komórkowej i wymaga ustalenia przed rozpoczęciemhodowli. Przepływosmotyczny  Kierunek przepływu wody przez półprzepuszczalną membranę jest uwarunkowany gradientem stężeń białek po jej obu stronach. W przypadku, gdy płyn odżywczy nie zawiera surowicygradient stężeń pomiędzy przestrzenią hodowlaną a odżywczą jest ustalony. Taki stan może prowadzić w czasie trwania hodowli do wzrostu objętości przestrzeni hodowlanej.  Sterowanie powyższymi zmianami jest możliwe poprzez dodanie do medium podstawowego np. hydrolizatu białka (laktoalbumin). W wielu przypadkach nieznaczny

przepływ wody do przestrzeni hodowlanej jest bez znaczenia i może być kompensowany przez dodanie niewielkiej ilości surowicy do przestrzeni hodowlanej.  Zmiany w objętości przestrzeni hodowlanej mogą by powodowane przez różnice stężenia surowicy po obu stronach błony, przez dużą ilość komórek w przestrzeni hodowlanej.

3. Charakterystyka bioreaktorów mikronośnikowych. Wybór odpowiedniej strategii prowadzenia bioprocesu z udziałem komórek zwierzęcych jest istotne z powodu, np.:  Zastosowanie bioreaktora okresowego i wysokiego stężenia glukozy może spowodować inhibicję metabolizmu tlenowego –efekt Crabtreeoraz nadmierną biosyntezę mleczanów, które powodują stres i przedwczesną apoptozękomórek,  Zbyt wysokie stężenie glutaminy przyczynia się do wzrostu stężenia toksycznego amoniaku (powyżej 10 mM), który hamuje nie tylko wzrost komórek, a także glikozylacjębiałek,  efekt Crabtree–indukowane glukozą przełączenie z metabolizmu tlenowego na metabolizm oparty wyłącznie na glikolizie hodowle na mikronośnikach – komórki rosną na kulkach dekstranowych, żelatynowych, szklanych lub plastikowych, dzięki czemu osiąga się bardzo dużą powierzchnię wzrostu w małej objętości pożywki. Metodę hodowli na mikronośnikach zapoczątkował Wetze lw 1967 roku, poprzez wprowadzenie do zawiesiny komórek kulek dekstranowych –SephadexA-50, Zastosowanie stałych cząstek –szklanych, polistyrenowych, żelatynowych, celulozowychjako nośników, które umożliwiają adhezję komórek zwierzęcych, Ze względu na porowatość wyróżnia się cząstki mikro-i makroporowate, Przy cząstkach makroporowatychwzrost komórek nie jest ograniczony jedynie do powierzchni cząstek, ale następuje także w porach, wgłębieniach i kanalikach, Stosuje się nośniki o optymalnej średnicy 100 -250 μm, przy mniejszej średnicy niż 100 μm krzywizna powierzchni jest zbyt duża by możliwa była efektywna adhezja i powstawanie warstwy komórek, W idealnym przypadku komórki układają się na cząsteczkach jednowarstwowo, przy czym opisywano nakładanie się warstw, jak w przypadku komórek CHO, co nie wpływało jednak negatywnie na cały bioproces.

4. Charakterystyka bioreaktorów membranowych. W bioreaktorach membranowych możliwe jest uzyskanie wysokiej gęstości w obrębie kartidża, ale wymaga okresowego usunięcia części masy komórkowej,  Zapobiegamy w ten sposób zapychaniu systemu oraz nierównomiernej dystrybucji warunków holowanych w obrębie bioreaktora,  Zaletą tych bioreaktorów –membranowych= perfuzyjnych-w przemyśle jest ich wysoka wydajność produkcyjna,  Wadą –problemy podczas procesu zwiększania skali –scalingupi automatyzacji hodowli komórek zwierzęcych,

 Metodę perfuzyjną można stosować jedynie w kulturze typu chemostat, HOLLOW FIBER Pojęcie określające membranę definiuje ją jako trzecią fazę rozdzielającą dwie inne fazy, działającą jako pasywna lub aktywna bariera transportu masy między tymi fazami, Transport masy przez membranę może odbywać się wg mechanizmu konwekcyjnego lub dyfuzyjnego, W mechanizmie konwekcyjnym (mikrofiltracja, ultrafiltracja i nanofiltracja) porowatą membranę traktować można jako swoiste sito, będące barierą dla transportu niektórych składników rozdzielanego układu, o wielkości porów od nanometra do ułamka mikrona, W mechanizmie dyfuzyjnym (ekstrakcja membranowa, perwaporacja) rozdział zachodzi między cząsteczkami poszczególnych składników (separacja na poziomie molekularnym –jej efektywność jest większa, im większa jest różnica w wielkości cząsteczek będących składnikami rozdzielanej mieszaniny), Bioreaktor membranowy –zintegrowany system (urządzenie), w którym przebiegają jednocześnie: reakcja biochemiczna i separacja membranowa, przy czym zachodzi jednoznaczna relacja między parametrami obu tych procesów - Wykorzystanie reaktora membranowego ma sens gdy efektywność procesu zachodzącego w reaktorze membranowym jest większa niż efektywność procesów reakcji i separacji prowadzonych następczo. Metody, w których antygen lub przeciwciało sprzęga się z enzymem, a pomiar produktu powstającego w reakcji enzymatycznej rozkładającej określony substrat jest miernikiem ilościowym, Produkt reakcji jest barwny, a natężenie barwy zależy pośrednio od zawartości oznaczanego antygenu czy przeciwciała i jest mierzone z użyciem metod spektrofotometrycznych. Najczęściej stosowanymi enzymami są: Fosfataza alkaliczna AP (substrat – p nirofenylofosforan [p-NPP]) Peroksydaza chrzanowa HRP (substrat – o-fenylenodiamina [OPD])

5. Charakterystyka bioreaktorów typu wave bag. Składa się ze sterylnego worka plastikowego, wypełnionego w połowie ciekłym medium, a w połowie mieszaniną gazową,  Worek umieszczony jest na ruchomej, falującej platformie –zapewniającej łagodne mieszanie obu faz bez tworzenia się pęcherzy gazowych,  Bioreaktor jest połączony elastycznymi przewodami z pompami, co umożliwia wymianę fazy gazowej i dostarczanie pożywki,  Bioreaktory tego typu są stosowane do hodowli komórek zwierzęcych i owadzich, adherentnychi w zawiesinie,  jednak uzyskanie maksymalnego przemieszania płynów, z jednoczesnym minimalnym uszkadzaniem komórek jest możliwe poprzez zastosowanie plastikowych worków – DuPontINC –które „huśta” się na kołysce laboratoryjnej Komórki hodowane były w jednorazowych, sterylnych komorach –CellBagbioreactor

1 –zawór,  2 –podłączenie strzykawki,

 3 –wlot powietrza (z filtrem),  4 –wylot gazu (z utrzymaniem temperatury 40-50oC, zapobiega kondensacji pary)

Jednorazowa komora do hodowli,  Automatyczny system kontrolujący perfuzję,  Hodowla utrzymywana jest w określonej temperaturze dzięki systemowi podgrzewania umieszczonemu na spodzie kołyski,  Transport gazów odbywa się do przestrzeni miedzy płynem hodowlanym a górną powierzchnią komory (worka) (np. napowietrzanie -0,2 litry na minutę),  Gazy filtrowane, mieszanina O2 i CO2, lub dodatkowo wprowadzane tylko O2,  System wyposażony w sensory do pomiaru poziomu rozpuszczonego tlenu (DO, dissolvedoxygen) i pH,  W worku/komorze 10 l –objętość hodowlana to 4 l,  Mieszanie –25 rpm, 6owychylenie kołyski, Przepływ płynów i perfuzja były dostosowywane każdego dnia w celu utrzymania stężeniaresztkowegoglukozy–0,5 g/l,  Usunięcie inoculum–w takcie fazie log,  Perfuzja –1,5 objętości hodowli/dzień, w fazie końcowej –zwiększenie perfuzji do 3,7, NK (natrualkiller) cells–5% do 20% w PBMC (periferalbloodmononuclearcells),  Aktywacja NK prowadzi do proliferacji, produkcji cytokin i/lub aktywności cytolitycznej,  Z reguły komórki NK hodowane są w hodowli statycznej (staticbags, cultureflasks),  Ilości powyżej 2x109wymaga zastosowania więcej niż jednego naczynia hodowlanego, System WAVE Bioreactor2/10 daje możliwości hodowania WBC i osiągnięcie gęstości wyższej niż 10x106komórek/ml,  200 x 106komórek, 37oC, 5% CO2, 6 rpm, 6okąt wychylenia, napowietrzenie 0,1-0,2 Lpm, 0,02% Pluronic,  Uzyskano –wysoką koncentrację komórek przy znacznej redukcji kosztów, klasyczna hodowla –10 l dla uzyskania 2x1010komórek (2x106komórek/ml) hodowla typu wave5-6 l,  Mniejsze ryzyko kontaminacji, Wykorzystanie systemu typu wavedo produkcji białek z wykorzystaniem hodowli komórek owadzich Sf21,  Komórki poddano infekcji bakulowirusemzawierającym gen EGFP his-tag,  Komórki (0,5 x 106komórek/ml), MOI –0,02, 27oC, 100 rpm, 7 dni, 6. Opisz warunki hodowli w kontekście składu medium hodowlanego i metabolizmu komórkowego. Częstość wymiany medium odżywczego ma wpływ na wyniki hodowli. Dyfuzja medium przez półprzepuszczalną membranę odżywczą jest uwarunkowana gradientem stężeń

ustalonym pomiędzy płynem odżywczym i płynem stanowiącym roztwór dla rosnących komórek.  Wraz ze zubażaniem płynu odżywczego siła dyfuzji roztworu również ulega redukcji i następuje spadek masy żywych komórek w przestrzeni hodowlanej. Jest to również związane z akumulacją toksycznych metabolitów.  Medium odżywcze nie zmienia koloru tak intensywnie jak to ma miejsce w hodowli statycznej, z powodu ciągłego natleniania hodowli przez otwory w dnie przestrzeni hodowlanej następuje redukcja kwaśnych metabolitów. Zmiana barwy pożywki może więc być wskaźnikiem aktywności metabolicznej komórek, ale nie pozwala jednoznacznie przesądzać o konieczności wymiany płynu odżywczego.  Medium odżywcze powinno być wymieniane tak często, aby gradient stężeń po obu stronach membrany był jak najwyższy, co gwarantuje maksymalną dyfuzję składników odżywczych do hodowli. Metabolizm: W procesie glikolizy glukoza jest przekształcana do bursztynianu, który następnie preferencyjnie uczestniczy w cyklu TCA, by wytworzyć duże ilości ATP, a mniej w szlaku anaerobowym do produkcji mleczanu, à Stąd zużycie glukozy w komórkach hybrydomajest 6-8 razy większe niż w komórkach Sf-9, z jednoczesnym 2-3 krotnie większym użyciu O2przez komórki hybrydoma, à Z kolei komórki High-Fivew zawiesinie akumulują mleczany w stężeniu 7-16 mM, co pozwala stwierdzić, że zarówno dla komórek hybrydoma, jak i komórek owadów, efekt hamujący mleczanów może zależeć od konkretnego rodzaju komórek, Komórki wydzielają metabolity, które wpływają na zdolność wzrostu,  Wpływ negatywny –zmiany pH,  Wpływ pozytywny –produkcja czynników wzrostu,  Ważnym produktem katabolicznym w kulturach komórek ssaków jest amoniak,  Komórki owadów nie są tak wrażliwe na amoniak jak komórki ssaków,  Wzrostowi komórek Sf-9 zazwyczaj nie towarzyszy gromadzenie amoniaku, natomiast komórki High-Five gromadzą amoniak o stężeniu zależnym od początkowej zawartości glutaminy i asparaginy w pożywce hodowlanej.

Skład medium zapewnia składniki dla utrzymania aktywności metabolicznej komórek, ale stopień wykorzystania jest różny dla poszczególnych składników i zmienia się w zależności od fazy hodowli, Media hodowlane –EMEM (13 aa, 8 witamin, 6 rodzajów jonów), DMEM, RPMI 1640, F12, Skład medium zależy od typu komórek oraz od zastosowania hodowli, np. do produkcji wirusów wykorzystuje się głównie medium o podstawowym składzie MEM suplementowane surowicą, W innych badaniach, w których na wyniki mogą mieć wpływ niezdefiniowane czynniki (pochodzące z surowicy) lub w systemach large-scaledo produkcji, między innymi, białek wykorzystuje się media bez dodatku surowicy, Glukoza –standardowo 5-25 mM, Większość glukozy jest metabolizowana na drodze glikolizy do pirogronianu, który redukowany jest następnie do kwasu mlekowego (co prowadzi do kumulacji kwasu mlekowego w medium),

Jedynie mała porcja glukozy (20-30%) metabolizowana jest przy włączeniu cykl kwasów trikarboksylowychTCA i szlak pentozofosforanowy, Poza glukozą jako źródło energii komórki wykorzystują glutaminę, która w mediach hodowlanych występuje w relatywnie wysokim stężeniu (2-4 mM) w porównaniu z innymi aminokwasami, Hodowle wykazują wysokie zapotrzebowanie, w wielu hodowlach wykorzystanie glukozy i glutaminy odbywa się gwałtownie i może powodować limitowanie wzrostu jeszcze przed ich wyczerpaniem, Ten trend obserwowany jest częściej w mediach wolnych od surowicy lub z małym stężeniem białka

7. Znaczenie stresu mechanicznego pochodzącego z wytrząsania w hodowlach komórkowych na dużą skalę. Znaczenie stresu mechanicznego pochodzącego z wytrząsania w hodowlach komórkowych na dużą skalę. Ze względu na brak ściany komórkowej komórki ssaków i owadów nie mają możliwości skutecznej obrony przed zmianami osmolarności (komórki owadów w mniejszym stopniu) i przez długi czas były uznawane jako wrażliwe na ścinanie–czyli fizyczne uszkodzenia przez wirnik bioreaktora, Z tego względu do takich hodowli rekomendowano bardzo niskie poziomy wytrząsania około 0,01 W/kg dla bioreaktorów z mieszaniem, wyrażone jako średnie tempo rozpraszania energii medium (εT, W/kg), Takie warunki (przy niskim wytrząsaniu) doprowadzają jednak do heterogenności w stężeniu rozpuszczonych O2i CO2, a przede wszystkim pH podczas procedur przeprowadzanych na dużą skalę, W przypadku wartości około 0,01 W/kg była ona stosowana w starszych typach bioreaktorów, Dodatkowo wytrzymałość komórek można badać stosując metody mikromanipulacji, Użycie tej techniki pozwoliło stwierdzić, że komórki mogą wytrzymać więcej aktów energicznego mieszania niż początkowo sądzono, Badania tego typu przeprowadzono z wykorzystaniem turbin Rushtonao radialnym przepływie. Znaczenie: Komórki rosnące w postaci przylegającej do podłoża: orientują się i układają się zgodnie z kierunkiem przepływu cieczy, naprężenia ścinające o wielkości 0,1-1,0 N/m2 wpływają na morfologię komórek, poziom ekspresji genów, przepuszczalność komórek dla płynów i jonów, naprężenia ścinające o wielkości 0,50-10,0 N/m2 mogą odrywać komórki od podłoża, istotny wpływ na naefekty biologiczne naprężeń ścinających ma czas ich działania, np. działanie naprężeń ścinających 6N/m2 powoduje zmniejszenie ilości żywych komórek BHK i CHO o 50% po co najmniej 3h. Z kolei naprężenie ścinające 0,75-1,0 N/m2daje ten sam efekt po co najmniej 24h. Istotne znaczenie ma zatem ilość energii przekazanej do komórek. Zmiany morfologii i wydłużanie się komórek nabłonkowych poddanych naprężeniom ścinającym przedstawia poniższy rysunek: a-kontrola, brak naprężeń, b -naprężenia 1,3 N/m2 w czasie 4h, c-naprężenia 1,3N /m2. w czasie 24h.

8. Opisz warunki hodowli w kontekście powierzchni wzrostu i charakterystyki wzrostu komórkowego. Opisz warunki hodowli w kontekście powierzchni wzrostu i charakterystyki wzrostu komórkowego. Komórki owadzie i ssacze–mogą wzrastać w zawiesinach w różnego rodzaju naczyniach – cylindrycznych, płaskościennych, butelkach z napowietrzaniem, naczyniach z mechanicznym mieszadłemlub bioreaktorach airliftoraz barbotażowych. Podobnie jak komórki mikroorganizmów, komórki owadów i ssaków mogą wzrastać w hodowlach wsadowych, hodowlach wsadowych z uzupełnianiem medium lub hodowlach ciągłych. W przypadku hodowli komórek adherentnych konieczne jest prowadzenie hodowli w oparciu o mikronośniki. Mikronośniki dostarczają znacznie większej powierzchni na jednostkę objętości niż tradycyjne systemy wzrostu. W mniejszej skali płytki (wielowarstwowe systemy) lub hodowle typu roller bottles. Właściwe warunki wzrostu komórek zapewnia ich pasażowanie i rozcieńczanie w świeżej pożywce do stężenia około 4x105komórek/mL(zależnie od linii komórkowej), Zwykle proces wzrostu trwa do 5 dni, po czym końcowe stężenie komórek osiąga około 5x106komórek/mL, W przypadku komórek adherentnych – wykorzystuje się enzymy proteolityczne głównie trypsynę, W przypadku komórek rosnących w zawiesinie także mogą przylegać do ścian naczyń, w takiej sytuacji łatwo je oddzielić od przez wytrząsanie, Regularne pasażowanie pozwala zachować biologiczne właściwości linii komórkowych przez nawet 3 miesiące Mieszanie, jest konieczne dla efektywnej wymiany gazów oraz zapobiegania tworzenia się gęstej warstwy sedymentacyjnej, - Wysokość płynu powyżej 5 –10 cm (istotny jest stosunek powierzchni wzrostu do objętości) wymaga dozowania CO2 i powietrza dla utrzymania właściwej wymiany gazowej, - Szybkość mieszania –30 –100 rpm, wyst...