Hoofdstuk 8.2 - Elektroforese PDF

Preview

Summary

Download Hoofdstuk 8.2 - Elektroforese PDF

Description

H8.2: Elektroforese 8.2.1 Principe van elektroforese 8.2.1.1 Algemene formule Beweging van geladen molecule in elektrisch veld = elektroforese. Molecule kan nettolading q=ze dragen met e = eenheidslading en z = aantal eenheidsladingen => in elektrisch veld E: F=qE=zeE. Met E = φ/d met φ=potentiaal en d = afstand tussen elektroden => veroorzaakt versnelling tot snelheid v wrijvingskracht F’ veroorzaakt gelijk en tegengesteld aan elektroforetische kracht: F’ = f. dx/dt als Fe = F’ => qE=f. dx/dt Snelheid: dx/dt = u = qE/f Elektroforetische mobiliteit: U = u/E = (qE/f)/e = q/f => U kan vergeleken worden met sedimentatie coêfficiënt s voor centrifugatie! Wet van Stokes: f = 6pi ηR met f =frictiecoëfficiënt, η viscositeit, R radius => U = u/E = ze/6 piηR

8.2.1.2 Elektroforese en ionische sterkte Enkel als macromolecule is opgelost in solvent zonder tegenionen => macro-ionen omgeven door ionenwolk die elektroforetische mobiliteit verlagen door: -

Daling effectieve lading van macro-ion Elektrisch veld verplaatst ionenwolk tov geladen molecule waardoor beweging vertraagd wordt = elektrostatische wrijving.

Debye en Hückel: tegenionen verlagen lading van macro-ion naar ze/1+kR => U = ze/6piηR . 1/1+kR met k = omgekeerde van straal r waarover macromoleculen elkaar kunnen beïnvloeden afhaneklijk van ionische sterkte I:

√

k=

8 πN e2 . I ε kb T

met ε = diëlektriciteitsconstante van oplossing,, kb =

boltzmann-constanste, T = absolute temperatuur en N = getal van Avogadro. Voor hoge ionsterkte is k groot => daling in effectieve lading van macro-ion => straal r waarover macromoleculen elkaar kunnen beïnvloeden is klein => geen bepaling doen van lading

8.2.1.3 Elektroforese van macro-ionen Proteïnen, RNA en DNA => lading door zure en basische groepen => migreren in elektrisch veld bij pH verschillend van pI. Migratie wordt bepaald door verhouding van lading tot massa. Voor RNA en DNA is verhouding constant in groot pH gebied. => zowel grote als kleine nucleïnezuren hebben ongeveer dezelfde migratiesnelheid. Voor eiwitten is pH zeer kritisch, hoe verder pH van pI hoe groter effectieve lading van eiwit MAAR als in aanwezigheid van SDS => detergent-eiwitcomplexen zelfde lading/massa verhouding over breder pH gebied => geldt enkel als uitgevoerd in buffer. MAAR elektroforese in netwerk die voor weerstand zorgt (dunne lagen of gelsystemen) => scheiding op basis van grootte: kleinere moleculen geraken gemakkelijker door mazen van netwerk waardoor ze sneller migreren tov grotere moleculen. Bufferoplossingen zo kiezen zodat:

-

pH in elektrode reservoirs en in drager constant blijf elektroliet concentratie aanvaardbaar is om stroom te dragen, als concentratie te laag is zullen macromoleculen stroom dragen en bewegen snel door systeem met slechte scheiding tot gevolg. Als elektroliet concentratie te hoog is zal stroom door systeem groot zijn bij lage spanning => opwarming en trage beweging van macromoleculen. - Elektroforese buffer mag niet reageren met macromoleculen tijdens migratie

8.2.2 Types van elektroforese 8.2.2.1 Dinlaagelektroforese Vervangt papierelektroforese volledig => platen bedekt met drager, dunlaagplaten worden bevochtigd en met papierwieken verbonden met elektrodebuffers. Hebben lage ionensterkte en kunnen vluchtige stoffen bevatten zodat elektroforese best uitgevoerd wordt in afgesloten systeem. Geladen moleculen bewegen als spanning => gebruiken van geladen kleurstoffen om elektroforese te volgen=> bewegen door drager dat als zeef fungeert. Bestaat ook 2D elektroforese of elektroforese in 1 richting gecombineerd met chromatografie in andere richting. Na elektroforese worden stoffen zichtbaar gemaakt met kleurreactie.

8.2.2.2 Gelelektroforese Macromoleculen gescheiden in gepolymeriseerd gelsysteem. Gels hebben hoge capaciteit en gecontroleerde porositeit, verhinderen convectie, minimaliseren diffusie en laten vlotte elektroforetische beweging toe. Scheiding is gebaseerd op moleculair zeefeffect. Vooral agarose en polyacrylamide als gelsysteem Agarose gelelektroforese Voor scheiding van nucleïnzuren, gevormd door in oplossing brengen van agarosepoeder. Concentratie tussen 0.5-8%, agarose netwerk wordt gestabiliseerd door H-bruggen en poriëngrootte wordt bepaald door concentratie aan agarose. Grote poriën met lage agarose concentraties en maken scheiden van macromoleculen met hoge molecuulmassa mogelijk. Vereist geen polymeriserend agens maar polymeriseert spontaan bij afkoelen. Lading/massa verhouding van polynucleotiden is onafhankelijk van basesamenstelling dus bij elektroforese in oplossing zonder dragergel => weinig mobiliteitsverschil tussen nucleotiden => vooral bepaald door zeefeffect van drager. Relatie tussen afgelegde afstand en molecuulmassa: Rf = A-B logM met Rf = afgelegde afstand en M is molecuulmassa, A en B zijn afhankelijk van systeem en experimenteel te bepalen met referentie moleculen => snelheid daalt logaritmisch met stijgende molecuulmassa. Polyacrylamide gelelektroforese = PAGE is meest gebruikte elektroforetische methode voor scheiden van eiwitten maar wordt soms toegepast voor scheiding van korte nucleïnezuren. Gels worden gevormd door polymerisatie van acrylamide en N-N’-methylenebisacrylamide in aanwezigheid van radicalen die worden geleverd door ammonium persulfaat. Poriêngrootte bepaald door concentratie en verhouding. Samenstelling gedefinieerd door totale concentratie aan acrylamide/bisacrylamide T en concentratie aan crosslinker C. T = a+b/V 100% en C = b/a+b . 100% Door T en C te veranderen => gels met verschillende porositeit.

Polyacrylamide gelelektroforese in continu buffersysteem Als elektroforese uitgevoerd met 1 zelfde buffer (constante pH en ionensterkte) in staal, gel en in elektrode => continu systeem. Als moleculen gelijke M/z verhouding hebben => scheiding enkel bepaald door zeefeffect. NADEEL: grootte van staal bepaalt breedte van banden. Polyacrylamide gelelektroforese in discontinu buffersysteem Buffersamenstelling verschilt in verschillende compartimenten van systeem. Opgebouwd uit 2 boven elkaar aangebrachte gels = scheidings- en concentratiegel; Staal wordt geladen in kuipjes aangebracht in concentratiegel. Eiwitten worden geconcentreerd in concentratiegel voor ze scheidingsgel bereiken.  Concentratiegel: laag acrylamide percentage en lage pH 6.8  Elektroforesebuffer pH 8.3 en scheidingsgel pH 8.9 Scheidingsgel bevat veel Cl- ionen maar geen glycine (wel in EF-buffer). Als EF wordt gestart => migratie volledig gedissocieerde glycinemoleculen in concentratiegel => minder gedissocieerd => kleine fractie negatief geladen door pH => langzamer migreren dan Cl- waarvan lading onafhankelijk van pH. => ontstaan ionenvacuüm met spanningsverschillen tussen voorfront en glycine. Eiwitten gedragen intermediair tussen sterk negatief geladen en zwitterion. => Kohlraush reacties => concentraties proberen aanpassen [Cl-]>[SDS]>[glycine] => concentreren in scherpe band tussen glycine en Cl- ionen “gesandwiched” en geconcentreerd tussen ionenfronten. In scheidingsgel pH hoog en vervalt ladingsverschil zodat beide sneller zullen migreren dan eiwitten. Gescheiden op basis van zeefeffect Polyacrylamide gelelektroforese onder denaturerende voorwaarden Discontinue PAA elektroforese in aanwezigheid van detergenten waardoor eiwitten dissociëren in subeenheden en denatureren. Meestal: natriumdodecylsylfaat (SDS). Bij neutrale pH worden eiwitten gedenatureerd in aanwezigheid van SDS => S2-bruggen verbroken en eiwitten ontvouwen. Lading van eiwit wordt bepaald door gebonden SDS => gelijke lading/massa verhouding en elektroforetische scheiding wordt bepaald door moleculaire grootte. Relatieve mobiliteit daalt lineair met logaritme van molecuulmassa. Iso-elektrofocusering Eiwitten: veel positieve en negatieve groepen waardoor netto-lading afhankelijk van pH, hebben positieve lading bij zure pH en negatieve lading bij basische pH. Elk eiwit heet pI => nettolading 0. Eiwitten in pH-gradiënt bewegen tot plaats waar ze ongeladen zijn. Voor aanleggen gradiënt => buffer voor elke pH over gradiënt => commerciële synthetische amfoliet buffers = mengsels van kleine organische moleculen met verschillende combinaties van zure en basische groepen => verschillende pKa waarde => toegevoegd aan acrylamide => elk amfoliet naar pH gelijk aan pKa => bufferen. Door concentreren => bufferende capaciteit die pH-gradiënt stabiliseert. Eiwitmengsel met verschilende pI waarden zal in gradiënt bewegen tot alle eiwitten plaats bereikt hebben waar pH gelijk is aan pI. Bij 2D-GEF wordt iso-elektrofocusering gecombineerd met PAGE onder denaturerende voorwaarden

Detectie van eiwitten en nucleïnzuren na GEF Eiwitten zichtbaar maken door kleuring  Coomassie briljant Blue (CBB): eigenschap van eiwitten om kleurstoffen te binden. Rode vorm gaat over in blauwe vorm door binding aan eiwit. Bindt door sulfaatgroep aan geprotoneerde AZ. Gelkleuring is kwantitatief en detecteert 0.1µg eiwit. Bindt sterk aan arginine en zwakker aan histidine, lysine, tyrosine, tryptofaan en fenylalanine.  Zilverkleuring: meest gevoelige methode en detecteert minder dan 5ng eiwit. Zowel voor eiwitten als voor nucleïnezuren. Mechanisme: reductie van ionisch naar metallisch zilver, eiwit banden gevisualiseerd in gel door verschil in ox/red potentiaal. Zilvernitraat aanwezig in hele gel maar reageert met AZ in zure condities waardoor gemakkelijk te reduceren. Reductie zilverionen door oxidatie van formaldehyde onder basische condities => buffer waardoor reactie kan doorgaan tot eiwitbanden zichtbaar worden. zwavelbevattende AZ binden makkelijker => aanwezigheid vereist. Intensiteit is geen maat voor hoeveelheid. Macromoleculen fixeren => diffusie minimaliseren. Bij fixatie substanties uit gel elueren die kunnen interfereren.  Fluorochromen: noncovalent met eiwitten in polyacrylamidegels, gevoeliger dan CBB. Sypro Ruby = meest sensitieve en kan gedetecteerd worden bij golflengte van 450-610 nm. Voor kleuring van nucleïnezuren. Identificatie van eiwitten en nucleïnzuren na gelelektroforese Western blot Eiwitten worden na scheiding met SDS-PAGE door elektrisch veld overgedragen naar membraan (nitrocellulose of PVDF), blotbuffer is Tris. Methanol verwijdert SDS van eiwit en resulteert in renaturatie van eiwitstructuur, voor eiwitten met basische pI moet pH aanpassen => geen te kleine negatieve nettolading => traag bewegen in elektrisch veld. Membranen voor detectie van eiwitten: ondergedompeld in oplossing met antilichaam gericht tegen aanwezig eiwit. Na wassen => membraan incuberen met tweede antilichaam gericht tegen constante gebieden van primair antilichaam. Secundair is gekoppeld aan fluorescente groep of enzymatisch domein dat substraat kan omzetten met chemiluminescentie of kleurreactie. Bij terugkeer naar grondtoestand => licht uitgestraald die zwarting geef op fotografische plaat. Southern en Northern blot Respectievelijk DNA of RNA fragmenten gescheiden door elektroforese in agarose gels. Gescheiden nucleïnezuren worden overgedragen naar nitrocellulose membraan dor capilalriteit. Specifieke DNA of RNA sequenties worden gedetecteerd door incubatie van membraan met complementaire RNA of DNA sequenties via directe of indirecte merking. Identificatie door massaspectrometrie Banden uit gel snijden => hydrolyse door trypsine en denaturatie van bekmen peptiden in gelfragment => peptiden uit fragment elueren voor verdere analyse in massaspectrometer

8.2.2.3 Capillaire elektroforese = EF tehcniek die macromoleculen scheiden door combinatie van EF en elektro-osmose

Principe van elektro-osmose Wanneer elektrisch veld van hoge spanning aangebracht op oplossing in capillair met gefixeerde ladingen op binnenste wand. Inn fused-silica capillair zijn silanol groepen geïoniseerd tot negatief geladen silanoaat groepen bij pH boven 3. Positief geladen kationen van buffer zullen 2 binnenste lagen vormen op wnd. Eerste laag = gefixeerde laag en buitenste laag = mobile layer en wordt gestuurd in richting van negatief geladen kathode. Kationen reageren met watermoleculen => merendeel buffer migreren met mobiele laag => elektro-osmotische flow EOF van buffer. Maat is afhankelijk van veldsterkte en densiteit van ladingen op capillaire wand => proportioneel met pH dus EOF zal stijgen met pH tot alle groepen geïoniseerd zijn Snelheid: U= εϚ/η met Ϛ = zeta potentiaal van capillaire wand, ε = permittiviteit en η = viscositeit van buffer. Zetapotentiaal omgekeerd evenredig met ionensterkte => stijging concentratie => EOF dalen. Principe van capillaire elektroforese Door aanwezigheid anode en kathode => proces EF komt op gang. Elektroforetische mobiliteit kan experimenteelbepaald worden uit migratietijd en veldsterkte. Stel t_R = tijd die macromolecule nodig heef om te bewegen van begin capillair tot aan detector U = uE = (L_d/t_R)/(V/L) Combinatie van elektro-osmose en elektroforese Migratie van macromolecule in bufferoplossing zal van beiden afhangen. In typisch systeem EOF in richting van kathode (naar destination reservoir). Macromoleculen worden gescheiden door differentiële elektroforetische mobiliteiten en migreren naar elektrode met tegengestelde lading. snelheid u+u0 = (U+U0)E => alle macromoleculen meegetrokken met buffer naar kathode. Negatief geladen macromoleculen langer weerhouden door tegengestelde elektroforetische mobiliteit. Volgorde van migratie langs detecter: kleine multivalente kationen snel, kleine multivalente anionen sterkst weerhouden. Performantie vergelijken: N = U_x.v/2D met U_x = schijnbare mobiliteit van solute en D = diffusiecoëfficiënt van macromolecule meestal bepaald door dynamic light scattering. Verstrooiing gemeten in zeer klein volume zodat aantal macromoleculen aanwezig in volume fluctueert tijdens tijd door diffusie.  Scheidingsefficiëntie enkel beperkt door diffusie en is proportioneel aan sterkte van E  Hoge scheidingsefficiëntie bekomen door hoge voltages  Scheidingsefficiëntie van capillaire EF hoger dan bij andere types scheidingen want geen bandverbreding door massa overdracht. Flow profiel bij EOF is vlak => minder bandverbreding => veel theoretische platen....