DNA-elektroforese - Practicum over Gel-electroforese PDF

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Practicum over Gel-electroforese...

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1 Naam : ………………………………………………………………………………… Klas : 6GWW/ 6TW

Nr. : ……

Vak : Toegepaste biologie

Datum : ……………………………

Leerkracht : A. Vandenabeele

Labo: DNA-fingerprinting d.m.v elektroforese Evaluatie

Attitude:

/5

Inhoud:

/25

Totaal:

/30

1. Inleiding: van het nemen van een DNA-staal tot het ontmaskeren van de dader  Opd ep l a a t sv a ne e nmi s d a a dwo r d e nv a a kDNAs t a l e ng e n o me n . Hi e r v o o r h e b b e nd e s p e u r d e r ss l e c h t sh e e l we i n i gme n s e l i j kma t e r i a a l n o d i g: e e nh a a r t j e , e e nb l o e d -o f s p e r ma v l e k , wa t s p e e k s e l , …. Ui t d i t ma t e r i a a l wo r d t h e t DNAv a nd ed a d e r g e ï s o l e e r d , e nme nk a nd i t d a nl a t e rg a a n v e r g e l i j k e nme t h e t DNAv a ne e nv e r d a c h t e . Al sh e t DNAp a t r o o no v e r e e n k o mt , d a n h e e f t me ne e ns l u i t e n db e wi j sd a t d ev e r d a c h t eo o ke ff e c t i e f d ed a d e r i s . Me nn o e mt d i t f or e ns i s c heDNAa na l y s eof DNAfin ge r pr i nt i ng.  Di t k l i n k t a l l e ma a l h e e l e e n v o u d i g , ma a r h e t p r o c e sv a ns t a a l n a met o t DNAp a t r o o ni s a r b e i d s i n t e n s i e f : ST AP1 : h e t DNAmo e t e e r s t z e e r z o r g v u l d i gwo r d e ng e ï s o l e e r d , wa n t d i k wi j l s h e e f t me ns l e c h t sh e e l we i n i gma t e r i a a l ( 1h a a r t j e , 1d r u p p e l t j es p e e k s e l , …) . Di t g e b e u r t d . m. v . s p e c i a l et e c h n i e k e nd i eweh i e r n i e t b e s p r e k e n . ST AP2 : Dev o l g e n d es t a pi sh e t v e r me e r d e r e nv a nh e t DNA. Di t i sn o d i go md a t me nz o d a n i gwe i n i gDNAh e e f t , d a t me nh i e r g e e nDNAp a t r o o nv a nk a n o p s t e l l e n . He t v e r me e r d e r e nv a nh e t DNA( =e x a c t ek o p i e ë nma k e n ) g e b e u r t d . m. v . d ePCRt e c h n i e k .

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PCR=pol y me r a s ec ha i nr e a c t i on: d i t i se e np r o c e sd a t wo r d t u i t g e v o e r di n e e ns p e c i a a l PCRt o e s t e l , wa a r i nd et e mp e r a t u u rc o n s t a n t wo r d t v e r h o o g de n v e r l a a g d . Me nb r e n g t i ne e np r o e f b u i sh e t g e ï s o l e e r d eDNA, s a me nme t 2s o o r t e np r i me r s , e nh e t e n z y meDNAp o l y me r a s e . De z ep r o e f b u i ss t e e k t me nd a ni nh e t PCRt o e s t e l , wa a r d o o rd et e mp e r a t u u rv a nd i t me n g s e l c o n s t a n t wo r d t v e r h o o g de n v e r l a a g d . 1 ) Wa t g e b e u r t e r me t h e t me n s e l i j k eDNAa l sd et e mp e r a t u u r s t i j g t ?

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2 ) Wa t g e b e u r t e r me t h e t DNAe nd ep r i me r sa l sd et e mp e r a t u u r we e r d a a l t ?/ 1

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3 ) Wa t z i j np r i me r s ?

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4 ) Wa a r v o o rd i e n t h e t DNAp o l y me r a s e ?

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5 ) Kl e u rd efi g u u r o pb l z . 1z o d a t h i j d u i d e l i j k e r wo r d t .

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BESLUI T : PCR=_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _i se e nt e c h n i e kd i ewo r d t / 5

g e b r u i k t o mDNAt e_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ . Di t g e b e u r t d o o r _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _e n_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ a a nh e t DNAt o et ev o e g e n , e nd et e mp e r a t u u r t el a t e n s c h o mme l e n . Ui t e i n d e l i j kb e k o mt me nme e r / mi n d e rDNAd a nh e t s t a r t DNA, e n b o v e n d i e ni sa l h e t ‘ g e p r o d u c e e r d e ’ DNA_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _a a nh e t s t a r t DNA.

ST AP3 : Nad ePCRh e e f t me nv o l d o e n d eDNAo mme ev e r d e r t ewe r k e n . Me ng a a t n ur e s t r i c t i e e n z y me nb i j h e t DNAv o e g e n . De z er e s t r i c t i e e n z y me n z i j ne i g e n l i j k“ k n i p p e r s ” : z eg a a nh e t DNAo pb e p a a l d ep l a a t s e nk n i p p e n , z o d a t a l l e e nDNAf r a g me n t e no v e r b l i j v e n . De z eDNAf r a g me n t e nh e b b e ne e n v e r s c h i l l e n d eg r o o t t e . Ma a kh i e r v a ne e nt e k e n i n g:

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ST AP4 :Di t me n g s e l v a nDNAf r a g me n t e ng a a t me nn uv e r d e ro n d e r z o e k e n . Me ng a a t e e r s t d ef r a g me n t e nv a ne l k a a r s c h e i d e no pb a s i sv a nd eg r o o t t e : h i e r v o o r g e b r u i k t me nh e t p r i n c i p ev a nDNAe l e k t r o f o r e s e . DNAe l e k t r of or e s ei se e nt e c h n i e kwa a r b i j me nd eDNAf r a g me n t e nd o o r e e n a g a r o s e g e l l a a t b e we g e no . i . v . e e ne l e k t r i s c h es t r o o m. DNAf r a g me n t e nz i j n n e g a t i e f g e l a d e n , e nwo r d e nd u sa a n g e t r o k k e nd o o r d ep o s i t i e v ep o o l . De k l e i n e r ef r a g me n t e ng a a ng e ma k k e l i j k e rd o o r d eg e l k u n n e nb e we g e nd a nd e g r o t e , e nd u sk r i j gj ee e ns c h e i d i n go . b . v . d eg r o o t t ev a nd ef r a g me n t e n . Des a me n s t e l l i n gv a nd eg e l k u nj ev e r g e l i j k e nme t e e ns p o n s a c h t i gn e t we r k : e r z i t t e nk l e i n eo p e n i n g e ni nwa a r d o o r mo l e c u l e nk u n n e nb e we g e n , ma a r h o e g r o t e r d emo l e c u l e , h o emi n d e r s n e l d i ev o o r u i t g a a t .

ST AP5 :Nad es c h e i d i n gv a nd eDNAf r a g me n t e n , g a a t me ne e nk l e ur s t of t o e v o e g e no mh e t DNAz i c h t b a a rt ema k e n . Des c h e i d i n gi nf r a g me n t e ni sd a n h e e l d u i d e l i j kt ez i e n , e nd i t n o e mt me t e e nDNAp a t r o o no f DNAp r o fi e l .

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Al sh e t DNAp a t r o o ni d e n t i e ki s , d a nma gj eb e s l u i t e nd a t h e t o o r s p r o n k e l i j k e DNAv a nd e z e l f d ep e r s o o nwa s .

2.Wat gaan wij doen?

Wi j h e b b e nd r i eDNAs t a l e no mme et ewe r k e n : he t r e f e r e nt i e s t a a l ( REF) :d i t i sh e t DNAs t a a l d a t g e n o me nwe r do pd ep l a a t sv a nd e mi s d a a d , e nv e r me n i g v u l d i g dwe r dd . m. v . PCR. v e r da c ht e1( V1 ) :h e t DNAs t a a l v a nv e r d a c h t e1 , v e r me n i g v u l d i g dd . m. v . PCR v e r da c ht e2( V2 ) :h e t DNAs t a a l v a nv e r d a c h t e2 , v e r me n i g v u l d i g dd . m. v . PCR Weg a a nd e z es t a l e nd o o r e e na g a r o s e g e l l a t e nl o p e n , e nd a nh e t b a n d e n p a t r o o nv e r g e l i j k e n o md ed a d e r a a nt ewi j z e n . Opme r k i ng: e r i ss l e c h t s1s t a a l a a n we z i gv a nREF , V1e nV2 . De z es t a l e nwo r d e ne n k e l d o o r d el e e r k r a c h t b e h a n d e l de no pd eg e l g e s t o k e n ! Det e c h n i e kv a nh e t l a d e nv a nd eg e l e nh e t g e b r u i kv a nd emi c r o p i p e t wo r d t d o o r i e d e r e e n g e o e f e n da . h . v . a n d e r es t a l e n .

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3. Werken met een micro-pipet OPGELET !De z ep i p e t t e nz i j nh e e l n a u wk e u r i g . Dea c c u r a a t h e i dv a nd ep i p e t k a ne n k e l b e h o u d e nwo r d e na l sz eo pd ej u i s t ema n i e r wo r d t g e b r u i k t , e nv o o r z i c h t i gb e h a n d e l d . L a a t z e d u sz e k e rn o o i t v a l l e n , e nv o l gd ei n s t r u c t i e s ! ! 1 1 . St e l h e t o pt en e me nv o l u mei nd o o ra a nd eo r a n j e( o f b l a u we ) k n o pt e d r a a i e n . OPGEL ET! Z o r gs t e e d sd a t j eb i n n e nd ea a n g e d u i d eh o e v e e l h e d e nb l i j f t ! Dr a a i d ep i p e t d u sn o o i t o n d e r 5µ l o f b o v e n5 0µ l , z o n i e t b l o k k e e r t d e p i p e t e nwo r d t z eo n b r u i k b a a r ! 1 2 . Ne e md ep i p e t i nd ep a l mv a nj eh a n d , z o r ge r v o o rd a t d er o n d eh a a k o v e rj ewi j s v i n g e r h a n g t e nj eme t j ed u i mma k k e l i j ko pd eo r a n j ek n o pk a n d u we n . 2 3 3 . Pl a a t se e nt i p j eo ph e t fi j n eu i t e i n d ev a nd ep i p e t . 4 5 4 . Dr u kv o o r z i c h t i gd eb o v e n s t ek n o pi n , t o t j ee e ne e r s t ewe e r s t a n d v o e l t : o pd i t mo me n t i s , d ej u i s t eh o e v e e l h e i dl u c h t , o v e r e e n k o ms t i gme t h e t i n g e s t e l d ev o l u me , u i t d ep i p e t g e d r u k t . 6 7 5 . Ho u dd ek n o pi n g e d r u k t ( n i e t h a r d e rd u we n ! )e np l a a t sd ep i p e t i nd e o pt ez u i g e nv l o e i s t o f . OPGEL ET! Bi j h e t o p z u i g e n , mo e t a l l e e nd ep u n t v a nh e t t i p j ei nd e v l o e i s t o f wo r d e ng e d o o p t ! 1 6 . L a a t d ek n o pv o o r z i c h t i gn a a r b o v e nk o me n : d ev l o e i s t o f wo r d t i nd e t i po p g e z o g e n . Ne e md ep i p e t u i t d ev l o e i s t o f . 2 3 7 . L a a t d ev l o e i s t o f e ru i t l o p e nd o o r d ek n o pv o l l e d i gi nt ed r u k k e n ( v o o r b i j d ee e r s t ewe e r s t a n d ) . Hi e r d o o r wo r d t e r e e ne x t r ah o e v e e l h e i d l u c h t d o o r d ep i p e t g e s t u u r dwa a r d o o r z e k e r a l d eo p g e z o g e nv l o e i s t o f u i t d ep i p e t wo r d t g e d u wd . 4 5 8 . V e r wi j d e rh e t g e b r u i k t et i p j ed o o rme t j ed u i m 6 d et o e t sn a a r b e n e d e nt ed u we n . He t t i p j ewo r d t n uv a nd ep i p e t g e d u wd .

Cont r ol ev a ndet e c hni e kdo ordel e e r k r a c ht : / 5

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4. Het laden van de gel  DeDNAf r a g me n t e nwo r d e nd o o r d el e e r k r a c h t o pd eg e l g e l a d e n , ma a r i e d e r e e nma g 1s t a a l t j ez e l f o pd eg e l l a d e n( wa t e r +l a d i n g s b u ff e r ) .De z es t a a l t j e sz u l l e na c h t e r a f n a t u u r l i j kn i e t z i c h t b a a rz i j n , a a n g e z i e ne r g e e nDNAi n z i t .  We r k wi j z e : p i p e t t e e r1 2μ l wa t e r i ne e ne p j e p i p e t t e e rd a a r n a5μ l l a d i n g s b u ff e r i nh e t z e l f d ee p j e Wa a r v o o rd i e n t d e z el a d i n g s b u ff e r ? / 2

me n gd i t g o e d , d o o r e e np a a rk e e r o pe nn e e r t ep i p e t t e r e n l a a dd i t me n g s e l o pd eg e l : b r e n gv o o r z i c h t i gd ep u n t v a nj ep i p e t i nh e t s l o t j e , e nd u wd ep i p e t l e e g . Pa so pd a t j en i e t d o o rd eg e l p r i k t ! ! Do ed i t v o o r z i c h t i ge nn i e t t es n e l , z o d a t h e t s l o t j en i e t o v e r l o o p t .

5. Ontmasker de dader Kl e e f h i e r d ef o t ov a nd eg e l :

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8 BESL UI T :

He t DNAp a t r o o nv a nV1 / V2k o mt o v e r e e nme t d i t v a nd er e f e r e n t i e , d u sd ed a d e r v a n h e t mi s d r i j f i sv e r d a c h t e 1 / v e r d a c h t e2 ....