Immunofissazione - riassunti PDF

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IMMUNOFISSAZIONE L'immunofissazione è un esame di laboratorio che consente di individuare e tipizzare le gamma globuline presenti in un campione biologico. Nel dettaglio, l'analisi permette di studiare - nel sangue o nelle urine del paziente - le classi di immunoglobuline (IgA, IgG, IgM, IgE o IgD) ed il tipo di catena leggera kappa o lambda, in funzione della loro specifica mobilità elettroforetica. Successivamente, per l'identificazione di quale globulina gamma sia chiamata in causa, l'immunofissazione prevede l'inoculo di antigeni specifici per il frammento o l'anticorpo corrispondente (antisieri anti-immunoglobulina): la presenza dell'alterazione sospettata è confermata dalla formazione di un precipitato, visibile ad occhio nudo o al microscopio. L'immunofissazione (o immunoelettroforesi, anche abbreviata nell'acronimo IFE) è una tecnica in grado di determinare se e quale classe di immunoglobuline (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) o tipo di catena leggera kappa o lambda, sia presente in eccesso o difetto nel siero sanguigno e nelle urine del paziente. Le catene leggere kappa e lambda caratterizzano la componente monoclonale, ossia gli anticorpi con la stessa identica struttura chimica. Immunofissazione Sierica e Urinaria: quando viene indicata? Le discrasie plasmacellulari o gammopatie sono un gruppo eterogeneo di disordini, ad eziologia sconosciuta, caratterizzati da: Sproporzionata proliferazione di un clone di cellule B; Presenza nel siero e/o nelle urine di un tipo d'immunoglobulina (o una sua subunità polipeptidica), strutturalmente ed elettroforeticamente omogenea (monoclonale). Normalmente, le discrasie plasmacellulari vengono diagnosticate utilizzando l'elettroforesi delle proteine sieriche e urinarie, seguita dall'immunofissazione sierica (IFE). Al contempo, può essere prescritto un esame del sangue per la misura della concentrazione totale delle immunoglobuline (IgG + IgM + IgA). L'immunofissazione è un esame che prevede due fasi (prima l'elettroforesi in gel d'agarosio, poi l'immunoprecipitazione con antisieri specifici). Il primo step dell'immunofissazione è uguale a quella dell'ELETTROFORESI delle proteine (o protidogramma), pertanto è necessario ricordare qualche concetto: L'elettroforesi è un'analisi di laboratorio che permette di determinare la quantità di proteine presenti nel siero sanguigno o in altri campioni biologici e, per ogni frazione, rivela se siano presenti delle anomalie in termini di qualità. In particolare, quest'esame consente di separare le proteine in cinque gruppi: albumina, alfa 1 globuline, alfa 2 globuline, beta globuline e gamma globuline; quest'ultime sono indagate in modo più specifico con l'immunofissazione. https://www.my-personaltrainer.it/imgs/2018/12/22/immunofissazione-cos-e-orig.jpegShutterstock L'elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche, attraverso una soluzione ed un mezzo di supporto inerte, sotto l'influenza di un campo elettrico, generato da una corrente continua. In pratica, l'esame sfrutta la carica elettrica e la massa molecolare delle proteine presenti nel campione del paziente. Sotto l'impulso di un campo elettrico, queste macromolecole migrano e si "raggruppano" per tipologia, rispondendo alla sollecitazione in un modo caratteristico. Il risultato (tracciato elettroforetico) è costituito da vari picchi e curve, a cui corrispondono le frazioni delle proteine. Normalmente, il primo picco, più alto e stretto, è quello dell'albumina; a seguire, si osservano i picchi delle globuline, molto più bassi rispetto all'albumina. L'aumento o la diminuzione in ampiezza ed intensità dei picchi che si formano nel tracciato indicano una maggiore o minore presenza delle proteine di ogni categoria; più proteine sono presenti in una banda, più alto è il rispettivo picco. Nel caso delle gamma globuline, se si vuole conoscere la quantità di ognuna delle diverse classi (IgA, IgM, IgG ecc.) sarà necessario ricorrere al dosaggio singolo. In linea generale, più gamma globuline sono presenti in una banda, più alto è il rispettivo picco; l'altezza corrisponde alla quantità totale delle proteine appartenenti a una determinata categoria. prevede: 1) Elettroforesi in Gel d'Agarosio: il campione del paziente (siero o urina) viene depositato su una striscia elettroforetica, cioè il supporto per la migrazione (di solito, gel di agarosio). Attraverso l'applicazione di un campo elettrico, generato da una corrente continua, si ottiene la separazione in diverse bande. In pratica, ogni tipologia di gamma globulina presente in miscela (cioè nel campione del paziente) migra in base alla massa molecolare ed alla carica elettrica. La diversa mobilità elettroforetica delle globuline gamma permette di identificarle (a ciascuna di esse coincide una specifica banda nel tracciato elettroforetico) e di osservare eventuali anomalie. 2) Immunoprecipitazione con Antisieri Specifici (Fissazione): sono aggiunti singolarmente, a ciascuna striscia elettroforetica, gli antigeni specifici per un determinato anticorpo o un frammento (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anticatena leggera kappa o anti-catena leggera lambda). Se è presente una proteina monoclonale, l'interazione dell'antigene con l'anticorpo corrispondente produrrà una banda stretta (ciò significa che il risultato è positivo) e la formazione di un precipitato, visibile ad occhio nudo o al microscopio. Infine, il campione viene processato (cioè lavato e colorato) per rimuovere le proteine che non sono precipitate, ottenere l'essicazione del gel e procedere con la lettura dei risultati. Immunofissazione Sierica

L'immunofissazione sierica prevede un semplice prelievo di sangue dalla vena di un braccio. Il siero è ottenuto per centrifugazione del campione biologico; ciò consente, infatti di separare la frazione contenente le cellule (parte corpuscolare) da quella liquida del sangue (plasma). Il siero sanguigno è privo dei fattori della coagulazione (fibrinogeno, fattore VIII, fattore V e protrombina). Immunofissazione Urinaria Per l'esecuzione dell'immunofissazione urinaria è necessario raccogliere una piccola quantità di urine in un apposito contenitore sterile. In base alle indicazioni del medico e del laboratorio, il campione può essere raccolto senza una tempistica precisa (random) o nell'arco delle 24 ore. WESTERN BLOT Il western blot o immunoblot è una tecnica biochimica che permette di identificare una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici; in generale, per facilitare il riconoscimento, la miscela di proteine viene prima separata in base alle loro dimensioni (o peso molecolare) utilizzando un gel di poliacrilammide (ma esistono variazioni quali il dot blot o slot blot, in cui la miscela proteica non viene separata in base alle dimensioni, ma ci si affida alla selettività antigene/anticorpo); successivamente le proteine vengono trasferite su un supporto, che comunemente è una membrana di nitrocellulosa, e quindi si procede al riconoscimento vero e proprio della proteina mediante l'utilizzo di un anticorpo specifico. Recentemente sono state messe a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, evitando quindi il trasferimento su membrana. Questa tecnica si usa quando il campione corso è composto da una miscela di moltissime proteine tali che con una colorazione standard (blu di Coomassie o nitrato di argento) non si riuscirebbe a distinguerle l'una dall'altra, oppure quando, pur avendo bande ben distinte (discrete), la proteina di interesse è in quantità troppo basse per essere visualizzata con altre tecniche. Infatti il western possiede tre passaggi in cui avviene l'amplificazione del segnale, ciò rende visibili anche decimi di picomole (10−12mol) di proteina. “l principio del western blotting (o Immunoblotting o Immunofissazione) si basa sull’identificazione, con un anticorpo specifico, di un determinato antigene (proteina) presente all’interno di una complessa miscela di antigeni (o proteine) separate in un gel di poliacrilammide in base al peso molecolare e immobilizzate su una membrana. Questo permette di monitorare ad esempio l’espressione proteica in una cellula e quindi di determinare la presenza, la quantità e il peso molecolare di uno specifico target.” Preparazione. i nostri campioni devono essere preparati in modo tale da poter passare agli step successivi. A livello pratico questo si esplica in: Lisi del campione: alle cellule viene aggiunta una soluzione di lisi. In questo modo si andranno a degradare le componenti cellulari (di cui non abbiamo bisogno) e si manterrà l’integrità delle proteine. Per favorire un miglior risultato, questa fase, può essere favorita da incubazioni ad alte temperature (es: 95 °C) o sonicazione. Isolamento delle proteine: una volta avvenuta la lisi, i campioni vengono centrifugati a massima potenza. La centrifugazione è un passaggio importante, in quanto permette una più semplice separazione tra le proteine (surnatante), che essendo più leggere rimarranno in alto, e debris cellulare (pellet) che si andrà, a causa del suo peso maggiore, a disporre sul fondo della nostra provetta. Basterà quindi aspirare il surnatante (miscela di proteine) ed il pellet invece verrà buttato. Dosaggio delle proteine: per effettuare una corsa più efficiente e più semplice da interpretare, è necessario che tutti i campioni di partenza contengano la stessa concentrazione di proteine. Tramite il dosaggio di proteine si identifica quindi il volume di ogni campione da caricare nel gel. Infine, basandosi sul volume finale del campione, vengono aggiunti un riducente (B-mercaptoetanolo) ed un tracciante (Blu di Bromofenolo). A questo punto i nostri campioni sono pronti per il fischio di inizio della corsa. Elettroforesi su gel poliacrilammide. Le proteine del campione sono separate usando l'elettroforesi in gel. La separazione di proteine può avvenire per punto isoelettrico (pI), peso molecolare, carica elettrica, o una combinazione di questi fattori. La natura della separazione dipende dal trattamento del campione e dalla natura del gel. Questo modo è il più usato per identificare una proteina. Il tipo più comune di elettroforesi in gel impiega gel di poliacrilammide (Elettroforesi su gel di poliacrilammide) e tamponi caricati con laurilsolfato di sodio (SDS). La SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) mantiene polipeptidi in uno stato denaturato una volta trattato con agenti riducenti forti per rimuovere strutture secondiarie e terziarie (esempio disolfuro [S-S] e gruppi mercaptani [SH e SH]) e permettere la separazione di proteine in base al loro peso molecolare. Le proteine campionate legano il SDS che conferisce loro carica negativa e si muovono in questo modo verso l'elettrodo positivo attraverso le mesh del gel. Le proteine più piccole migrano più velocemente attraverso questa mesh e le proteine vengono separate in base alla dimensione (misurata in kiloDalton, kDa). La concentrazione di

acrilammide determina la risoluzione del gel - maggiore la concentrazione, migliore la risoluzione di proteine a basso peso molecolare. Le proteine viaggiano solo in una dimensione lungo il gel per diversi blot. I campioni sono caricati in wells (pozzetti) nel gel. Una striscia è usualmente riservata per un marcatore o scala, una miscela commerciale di proteine con peso molecolare definito, tipicamente colorate così da formare bande colorate visibili. Quando la tensione elettrica è applicata lungo il gel, le proteine migrano attraverso esso a velocità differenti, in funzione della loro dimensione. Queste differenti velocità di avanzamento (mobilità elettroforetica) permettono la separazione in bande dentro ciascuna corsia. È inoltre possibile usare l'elettroforesi bidimensionale. nel western blotting viene effettuata L’elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio-dodecil-solfato (SDS-PAGE). Tramite questa tecnica, la separazione elettroforetica delle proteine avviene in condizioni denaturanti e la presenza dell’SDS, un detergente anionico (con carica negativa), annulla la carica propria delle proteine e le carica tutte negativamente: le proteine avranno tutte carica negativa netta e migreranno verso il polo positivo; la velocità di migrazione delle singole proteine dipenderà così solo dal loro peso molecolare. Preparazione del Gel: Ogni gel è costituito da due parti: Running o Resolving: parte inferiore, costituita da una percentuale di acrilammide maggiore (ES: 10-15%), con la funzione di separare le proteine in base al loro peso molecolare (è dove avviene la corsa vera e propria), un po’ come fosse la pista della competizione. Stacking: parte superiore del gel, dove alloggiano i pozzetti di caricamento dei campioni, costituito da una concentrazione minore di acrilammide (4-6%). La sua funzione è quella di concentrare il campione proteico caricato nei pozzetti, in modo tale che tutte le proteine presenti nella miscela inizino la loro corsa dallo stesso punto di partenza, un po’ come se fosse caratterizzato dai blocchi di partenza. Stacking gel e Resolving gel hanno gli stessi ingredienti ma in quantità diverse, un pH diverso ed una concentrazione di acrilammide (AA) diversa. Quest’ultima determina la grandezza delle maglie del gel: maggiore sarà la concentrazione, minori saranno le dimensioni dei pori del gel, più efficiente sarà la separazione delle macromolecole. Caricamento e corsa Il gel viene posto su un supporto per l’elettroforesi, i campioni vengono caricati all’interno degli appositi pozzetti nello stacking gel, insieme ad un marker e successivamente si imposta la corsa. Il tempo e la velocità di essa dipendono dall’esperimento e dalla taglia della proteina target che vogliamo identificare. 3. BLOTTING Una volta avvenuta la corsa, le proteine devono essere trasferite su membrana per renderle accessibili alle fasi successive, ovvero il riconoscimento dell’anticorpo. Le membrane più utilizzate per il western blotting sono quelle di nitrocellulosa o PVDF. Le PVDF sono costituite da un materiale differente da quelle di nitrocellulosa e per questo motivo resistono meglio allo stripping (vedi dopo) ed a differenza delle altre, prima dell’utilizzo devono essere attivate mediante incubazione di circa 1 minuto in metanolo. Per permettere il trasferimento: Preparazione del sandwhich: il gel viene posto all’interno di un sandwich così costituito: fogli assorbenti imbevuti in buffer di blottaggio, membrana di nitro o PVDF, gel, altri foglietti imbevuti. Blottaggio: Il sandwich viene posto all’interno di uno strumento (electroblotter) in grado di determinare un campo elettrico ortogonale al gel. In questo modo, le proteine si sposteranno dal gel alla membrana sottostante dove rimarranno immobilizzate. 4. SATURAZIONE Sulla nostra membrana ora saranno presenti, tutte le proteine dei nostri campioni, oltre quella di nostro interesse. Per favorire il riconoscimento specifico antigene-anticorpo e bloccare i siti aspecifici di legame, si procede a saturare la membrana con soluzioni proteiche. Le più utilizzate sono il Non Fat Milk (NFM) e Bovine Serum Albumin (BSA). Durante questa fase le membrane vengono poste su una contenitore e messe in bascula, il tempo di saturazione è di circa 1h. 5. LAVAGGIO ED INCUBAZIONE CON ANTICORPO PRIMARIO Dopo la fase 4) le membrane vengono lavate con una soluzione di TBS-T o PBS-T (detergente) al 5X, successivamente messe in incubazione con l’anticorpo primario. Per anticorpo primario si intende un anticorpo in grado di riconoscere, in maniera specifica, la nostra proteina di interesse. Solitamente, questi derivano da siero di animali (ratto, conigli) iniettati con la proteina target. Gli anticorpi primari utilizzati nel western blotting vengono di solito diluiti in determinate concentrazioni ed in BSA o NFM, in base alle informazioni fornite dall’azienda. Il tempo di incubazione con il primario può variare, molto spesso viene effettuato overnight.

6. LAVAGGIO ED INCUBAZIONE CON ANTICORPO SECONDARIO La membrana viene sottoposta di nuovo a lavaggio e successivamente incubata con anticorpo secondario. Per secondario si intende un anticorpo in grado di andare a riconoscere e legarsi all’anticorpo primario. Come anticorpo secondario si usa un siero di animale (di specie diversa da quella in cui è stato prodotto l’anticorpo primario), immunizzato con anticorpi della specie dell’anticorpo primario. Il secondario è, quindi, un anticorpo diretto contro la parte costante di un anticorpo di specie diversa. Questo anticorpo è marcato con un enzima (es: perossidasi) in grado catalizzare una reazione cromogena quando la membrana viene incubata con il substrato specifico per l’enzima stesso. Il tempo di incubazione con il secondario è di circa un’ora. 7. LAVAGGIO E RILEVAZIONE DELLA PROTEINA Dopo aver effettuato il lavaggio della membrana per eliminare l’eccesso, questa viene trattata con una soluzione substrato. Se la nostra proteina di interesse era presente sulla nostra membrana, la reazione a catena che sarà avvenuta sarà questa (Fig.1): Il primario si sarà legato alla proteina; Il secondario si sarà legato alla porzione costante del primario; Il substrato reagirà con l’enzima marcatore del secondario; Segnale. La rilevazione del segnale può essere svolta in diverse modalità, una delle più tradizionali è quella che utilizza la cassetta di esposizione in camera oscura, come i fotografi. La membrana viene posta in una cassetta di esposizione, sopra di essa viene adagiata una lastra/film in grado di essere impressionata, la cassetta viene chiusa, si attende un tempo determinato e poi la lastra viene posta prima in un liquido di sviluppo e poi in uno di fissaggio. Tutto ciò in camera oscura poichè sia la soluzione substrato che le lastre, che i liquidi sono sensibili alla luce. Questa tecnica non è complicata ma necessita di una certa abilità di esecuzione e di tempi più lunghi. Per questo motivo, ad oggi, vi sono tutta una serie di tecniche innovative di imaging che permettono di abbandonare la camera oscura. Questi sistemi (es: chemidoc) sono in grado di rilevare segnali colorimetrici, chemiluminescenti, fluorescenti, nel rosso, nel verde, nel blu ed a UV . STRIPPING E’ possibile ricercare più proteine in una stessa membrana e quindi in una stessa corsa. L’unica accortezza che deve esserci è l’uso di giusti anticorpi primari e secondari. Se le due proteine richiedono un anticorpo primario della stessa specie, questi interferiranno fra di loro. Per questo motivo si effettua prima la rilevazione di una proteina e successivamente si effettua lo “stripping”. In questa fase, la membrana viene posta in una soluzione a base di B-mercaptoetanolo, tris-hcl, SDS e acqua (spesso la soluzione viene fornita dal kit), in questo modo si va a rompere il legame della precedente proteina con il suo primario e la membrana è pronta ad accettare il secondo primario che andrà a rilevare l’altra proteina target, senza interferenze. Se i due anticorpi sono di specie differenti invece basterà rilevare la prima proteina e successivamente mettere in incubazione la membrana con il secondo primario. 8. ANALISI DEI DATI Esistono diversi programmi utili alla quantificazione dei picchi dei nostri segnali (Es: Image-j). Dopo aver ottenuto un numero associato alla quantità del nostro segnale, viene solitamente effettuata la normalizzazione. Per normalizzazione si intende il rapporto della proteina target sul suo totale o su quantificazione di una proteina di riferimento (housekeeping), solo in questo modo sapremo quanto effettivamente la nostra proteina è espressa, fosforilata, metilata, ecc. Limiti del test A causa della difficoltà e delle lunghe procedure del western blotting, questo può presentare molteplici limitazioni: Maggior probabilità di errore ed una bassa riproducibilità. Identificazione di un target poco rappresentato nel campione: trovare una proteina che risulta poco espressa nel nostro campione o valutare modifiche post-trascrizionali (fosforilazione, acetilazione) di proteine che non presentano un’adeguata concentrazione relativa può rivelarsi molto complicato, rischiando di ottenere un dato non statisticamente valido. Riconoscimento antigene-anticorpo: può avvenire che l’anticorpo primario o il secondario non siano estremamente efficienti nei confronti del nostro target, o...