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desarrollo farmacos, basado en macrofagos utilizados en ratas...

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Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación Publicado: April 29, 2015 doi: 10.3791/52749 Antonio Layoun1, Macha Samba1, Manuela M. Santos1,2 1

Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal, Institut du cancer de

Montréal, 2Département de Médecine, Université de Montréal

Abstract Durante la infección y la inflamación, los monocitos circulantes abandonan el torrente sanguíneo y migran hacia los tejidos, donde se diferencian en macrófagos. Los macrófagos expresan receptores de superficie de tipo Toll (TLRs), que reconocen patrones moleculares conservados a través de la evolución en una amplia gama de microorganismos. TLRs jugar un papel central en la activación de macrófagos que generalmente se asocia con la alteración de la expresión génica. Los macrófagos son críticos en muchas enfermedades y se han convertido en objetivos atractivos para la terapia. En el siguiente protocolo, se describe un procedimiento para aislar los macrófagos peritoneales murinos utilizando medio de tioglicolato de Brewer. Este último será impulsar la migración de monocitos en el peritoneo, en consecuencia esto elevará el rendimiento de los macrófagos por 10 veces. Varios estudios se han llevado a cabo

utilizando la médula ósea, el bazo o peritoneales macrófagos derivados. Sin embargo, los macrófagos peritoneales se mostró a ser más maduro tras el aislamiento y son más estables en su funcionaldad y fenotipo. Por lo tanto, los macrófagos aislados de la cavidad peritoneal murino presentan una importante población de células que pueden servir en diferentes estudios inmunológicos y metabólicos. Una vez aislado, los macrófagos fueron estimulados con diferentes ligandos de TLR y en consecuencia se evaluó la expresión génica.

Introduction El sistema reticuloendotelial fagocítica se compone de células en diversos tejidos y órganos tales como la médula ósea, la sangre, el hígado y el bazo. Los macrófagos se distribuyen ampliamente en todo el cuerpo, donde principalmente participan en innata y adaptativa la respuesta inmune para controlar las infecciones y claros. Además de su papel en la defensa del huésped, los macrófagos también juegan un papel importante en la cicatrización de heridas y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido

1,2.

Además, los macrófagos no sólo son

importantes para la función inmune, pero también participan activamente en la homeostasis del hierro

3.

En el cuerpo,

aproximadamente 80% de hierro está presente en la hemoglobina dentro de los eritrocitos, que cuando senescentes son fagocitadas por

los macrófagos

4.

Todos los días, estos macrófagos reciclan 25 mg de

hierro eritrocitos derivados y proporcionar su transporte en el plasma

5.

Por otra parte, durante la infección y la inflamación, los

macrófagos pro-inflamatorias secuestran hierro sérico para reducir DISPONIBIL hierrodad a los patógenos, tanto a nivel sistémico y local 8.

6-

Además, los estudios han demostrado que los macrófagos y

principalmente los hepatocitos producen un péptido antimicrobiano llamado hepcidina que es considerado el maestro regulador del metabolismo del hierro

9, 10.

La hepcidina se incrementa principalmente

por estímulos inflamatorios y es parcialmente responsable de secuestro de hierro en los macrófagos en inflamación crónica

11-13.

Como expresión

de hepcidina en los macrófagos no se entiende muy bien, hemos estudiado el posible papel de los receptores tipo Toll (TLR) en este reglamento. Los TLRs se encuentran principalmente en los macrófagos y juegan un papel central en su activación. Además, LPS expresión de hepcidina inducida en el hígado es dependiente de TLR4

13.

Por lo tanto,

para ejecutar nuestro estudio, hemos utilizado un método basado en el aislamiento de macrófagos peritoneales murinos. Líneas celulares de macrófagos se utilizan ampliamente en espárrago macrófagoss; no obstante, la cultura extendida puede provocar la pérdida de genes y la disminución de las funciones inmunes en estas

líneas celulares. Por lo tanto, el aislamiento de los macrófagos de la cavidad peritoneal es crucial. La cavidad peritoneal de ratón presenta un sitio ideal para cosechar los macrófagos

13-15.

Macrófagos peritoneales murinos aislados son

convenientes para varios estudios con respecto a su función inmunológica. Sin embargo, el número de macrófagos en el peritoneo es insuficiente para estudios extensos y se estima alrededor de 1 x 10 6 macrófagos por ratón. Por lo tanto, para aumentar la producción de macrófagos, un agente de provocar estéril tal como tioglicolato se inyectó en la cavidad peritoneal anterior a la cosecha de células. Después de la inyección de tioglicolato, el rendimiento de los macrófagos por ratón se incrementó en 10 veces. A pesar del aumento en los macrófagos rendimiento, tioglicolato actos medianas de cerveza como un irritante que induce una respuesta inflamatoria, lo que resulta en el reclutamiento de macrófagos, que may pero no es necesario afectar a la expresión génica. Por lo tanto, un grupo de control que consiste en macrófagos no tratados debe ser incluido en cada experimento. En nuestras manos, la expresión de hepcidina que está muy estimulada por la inflamación no se detectó en tioglicolato no tratado provocada macrófagos peritoneales. Por otra parte, los estudios han demostrado que tioglicolato de Brewer recluta numerosos

macrófagos, pero no activa ellos

16.

Por otro lado, tioglicolato de Brewer

suscitó macrófagos mostraron un aumento en la enzima lisosomal, pero una disminución en matar microorganismos ingeridos

17.

Sin embargo, la

capacidad fagocítica no se vio afectada en comparación con los macrófagos no-suscitó

16.

Una vez cultivadas en platos, los macrófagos peritoneales se convierten adherente, por lo tanto permitiendo su separación de otro tipo de células aisladas de la cavidad peritoneal. Posteriormente, los macrófagos aislados fueron desafiados con diferentes agonistas de TLR.Finalmente, el ARNm se extrajo de las células cultivadas y la expresión génica se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR).

Protocol Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales directrices después de la aprobación por el Comité institucional Cuidado de Animales del Centre de recherche du Centre Hospitalier de la Universidad de Montreal (CRCHUM).

1. El aislamiento, identificación, y Cultura de Murino macrófagos peritoneales

1. Preparar medio tioglicolato 3,8% de cerveza. Para ello, suspender 38 g de tioglicolato medio en 1000 ml de agua destilada. Llevar a hervir solución para disolver completamente el medio. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Almacene hasta 3 meses en la oscuridad, a temperatura ambiente NOTA: Desechar si la turbidez se desarrolla lo que indica una contaminación bacteriana. La solución puede conservarse durante un máximo de un año en la oscuridad si se mantiene estéril. 2. Uso de 1 ml jeringas unidas a agujas 23 G, inyectar 1 ml de 3,8% de tioglicolato de Brewer medio en la cavidad peritoneal de cada mouse y esperar durante 3 días. Use nueva jeringa y la aguja para cada ratón. 3. Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg / kg) y la eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Confirmar anestesia adecuada marcando la frecuencia respiratoria. Por lo general, las respiraciones rápidas indican que el ratón no está profundamente anestesiado. 4. Lavar el abdomen de cada ratón con etanol al 70%. Usando una tijera, realizar una incisión lateral a lo largo de la línea media inferior de la peritoneo. 5. Usando unas pinzas, tire hacia atrás la piel del abdomen para exponer la piel peritoneal transparente. Uso de 5 ml jeringas unidas a agujas 20 G, inyectar 5 ml de DPBS frío en la cavidad peritoneal de cada ratón. 6. Realizar un masaje suave en la cavidad peritoneal y luego aspirar el líquido cuidadosamente sin perforar cualquier órgano. Retire la aguja y dispensar el líquido peritoneal en 50 ml tubos de centrífuga cónicos. 7. Centrifugar durante 10 min a 400 xg en una centrífuga refrigerada.Las células deben mantenerse frío durante todo el procedimiento. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en medio RPMI 1640. 8. Utilizando un hemocitómetro, contar las células y adaptarse a la densidad de células a 1 x 10 células / ml. 9. Caracterizar el fenotipo de células aisladas por citometría de flujo utilizando 1 x 10 células por ratón y antibodie contra F4 / 80 (un antígeno de superficie expresada en macrófagos). 18.

6

6

2. Tratamientos Celulares 1. Directamente, después del aislamiento, agregue 1 x 10 células en cada pocillo. Deje los macrófagos peritoneales murinos para adherirse a las placas de 6 pocillos cultivándolas durante 1 a 2 horas a 37 ° C. Retire las células no adherentes lavando suavemente 3 veces con PBS caliente. 2. Posteriormente, las células de cultivo de 900 l DMEM libre de suero durante 24 horas en la presencia de los siguientes ligandos TLR: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); Poly (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagelina-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 mg / ml); ODN1826-TLR9 (1 M). NOTA: Prepararse para cada ligando una solución 10x. Añadir 100 l de este último a cada pocillo, realizando así una dilución de 10 veces. 6

3. Aislamiento de ARN 1. Eliminar todas las células medianas y lisan directamente en las placas de seis pocillos mediante la adición de 1 ml de TRIzol a cada pocillo y el lisado celular que pasa varias veces a través de una pipeta. Incubar las muestras homogeneizadas durante 5 a 10 min a TA, para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína. 2. Traslado lisado en 1,5 ml RNasa y tubos de microcentrífuga-DNasa libre. Añadir 0,2 ml de cloroformo por TRIzol 1 ml. Agitar los tubos vigorosamente a mano durante 15 segundos e incubar ellos a TA durante 5 a 10 min. Centrifugar a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C. Observar la mezcla se separa en una fase roja (fenolcloroformo) inferior, una interfase y una fase acuosa superior incoloro. ARN permanece exclusivamente en la fase acuosa. 3. TranSfer cuidadosamente la fase acuosa superior a un tubo nuevo sin perturbar la interfase. Precipitar el RNA de ella por la mezcla con 0,5 ml de alcohol isopropílico. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min y se centrifuga a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. El ARN

precipitados de la formación de un sedimento blanco en el lado y la parte inferior del tubo. 4. Eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet de ARN una vez con 1 ml de etanol al 75%. Mezclar las muestras mediante vórtex y centrifugar a 7500 xg durante 5 min a 4 ° C. Brevemente secar el ARN (secar al aire durante 10 min). Disolver ARN en 0,1 ml de DEPC (RNasa libre de agua) y se incuba durante 10 minutos a 55 ° C. 5. Cuantificar ARN usando un espectrofotómetro. Para ello, diluir las muestras 100 veces en agua DEPC y leer en longitudes de onda de 260 nm. La concentración de ARN será entonces: OD x 40 / ul x factor de dilución ng. 6. Igualar las concentraciones de ARN y síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante utilizando RT-PCR System para Kit primer capítulo de síntesis de cDNA. Comosegún las instrucciones del fabricante, medir los niveles de ARNm de genes por PCR en tiempo real (45 ciclos) en un sistema de detección de ADN en tiempo real. Normalizar los niveles de expresión de genes con genes de dos de limpieza, por ejemplo, β-actina y GAPDH. NOTA: Normalizar la concentración de ARN a 500 mg / ml y 0,5 mg usar para la síntesis de ADNc. Representative Results 260

En primer lugar, caracterizamos los macrófagos peritoneales murinos aislados por citometría de flujo. Para ello, hemos utilizado (F4 / 80) anticuerpos que reconocen específicamente marcadores única expresadas por los macrófagos. Se requiere esta caracterización para determinar el porcentaje de aislado de macrófagos y distinguirlos entre células obtenidas durante el proceso de aislamiento. Como se muestra en la (Figura 1), el porcentaje de células que expresan el antígeno F4 / 80 fue encontrado consistentemente a estar por encima de 95%. A continuación, para estudiar la expresión génica en macrófagos, las

células aisladas fueron tratados con varios ligandos de TLR: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) y FSL1 (TLR6 / 2). Posteriormente, los niveles de mRNA de hepcidina (Hamp), nuestro gen de interés, se midieron por RTPCR. Como se muestra en la (Figura 2), TLR1 / 2, TLR4 y TLR6 / 2 ligandos fueron capaces de estimular mRNA de hepcidina en macrófagos murinos

19.

En conjunto, estos resultados demuestran la utilidad de este

protocolo para el éxitoly aislar macrófagos peritoneales murinos y para investigar con precisión la regulación molecular de la expresión génica.

Figura 1. Caracterización de células aisladas de la cavidad peritoneal. Enriquecimiento de los macrófagos recuperados se confirmó por análisis de citometría de flujo usando el anticuerpo F4 / 80 después

de bloquear la tinción inespecífica con anticuerpos / CD32 CD16 y se encontró consistentemente a estar por encima de 95%.

Figura 2. TLR ligandos inducir la expresión de hepcidina en los macrófagos peritoneales murinos. Después murino aislamiento macrófagos peritoneal y la estimulación con TLR1 / 2, TLR4 y TLR6 / 2 ligandos, hepcidina niveles de mRNA fueron estudiados por reacción inversa cuantitativa cadena de la polimerasa con transcriptasa. Los datos se presentan como media ± SEM;nd (no detectable); * P...