Kinetika dan inhibisi reaksi enzimatis PDF

Preview

Summary

Makalah Biokimia KontemporerKINETIKA DAN INHIBISI REAKSI ENZIMATIS SERTA APLIKASINYAKELOMPOK IIIRISMA MAJDIYAH HBAHRUN HPROGRAM STUDI KIMIASEKOLAH PASCASARJANAUNIVERSITAS HASANUDDINMAKASSAR2019KATA PENGANTARPuji dan syukur kita panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat, taufik dan h...

Description

Makalah Biokimia Kontemporer

KINETIKA DAN INHIBISI REAKSI ENZIMATIS SERTA APLIKASINYA

KELOMPOK III RISMA MAJDIYAH

H012191007

BAHRUN

H012191021

PROGRAM STUDI KIMIA SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2019

KATA PENGANTAR Puji dan syukur kita panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat, taufik dan hidayah-Nya kepada penulis, sehingga makalah ini dapat terselesaikan dengan baik dan tepat pada waktunya. Adapun judul dari makalah ini “Kinetika dan Inhibisi Reaksi Enzimatis serta Aplikasinya”. Penulisan makalah ini bertujuan untuk memenuhi salah satu tugas yang diberikan oleh dosen penanggung jawab matakuliah Biokimia Kontemporer. Makalah ini ditulis dari data-data yang didapat dari beberapa sumber yang berkaitan dengan proses inhibisi dan kinetika rekasi enzimatis. Dengan membaca makalah ini diharapkan agar dapat menambah wawasan dalam Bidang Biokimia terkhusus mengenai kinetika dan inhibisi enzim, terutama bagi penulis. Penulis menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kata sempurna, untuk itu kami perlu kritik dan saran yang bersifat membangun. Baik dari dosen ataupun rekan-rekan yang membaca makalah ini.

Makassar, 8 November 2019

Penulis

A. KINETIKA ENZIM Kinetika enzim merupakan perhitungan kuantitatif dari kecepatan reaksi katalisis enzim dan faktor-faktor yang mempengaruhinya. Kinetika enzim menginvestigasi bagaimana enzim mengikat substrat dengan mengubahnya menjadi produk. Analisis kinetika reaksi enzimatis meliputi laju reaksi maksimum (Vmaks) dan konstanta Michaelis-Menten (KM). Dalam reaksi enzim dikenal kecepatan reaksi hidrolisis, penguraian atau reaksi katalisasi lain yang disebut velocity (V). Harga V dari suatu reaksi enzimatis akan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat [S], akan tetapi setelah [S] meningkat lebih lanjut akan sampai pada kecepatan yang tetap. Pada konsentrasi enzim tetap (tertentu) harga V hampir linier dengan [S]. Pada kondisi dimana V tidak dapat bertambah lagi dengan bertambahnya [S] disebut kecepatan maksimum (Vmaks). Vmaks merupakan salah satu parameter kinetika enzim. Parameter kinetika enzim yang lain adalah konstanta Michaelis-Menten, yang lebih dikenal dengan Km. Km merupakan konsentrasi substrat yang separuh dari lokasi aktifnya telah terisi, yaitu bila kecepatan reaksi enzim telah mencapai ½ Vmaks (Wiseman, 1989). Dalam keadaan sebenarnya, pada makhluk hidup dalam suatu saat tertentu jumlah suatu enzim nisbi tetap, sedangkan jumlah substrat yang harus diolah berubah-ubah sesuai dengan proses metabolisme. Hubungan ini sangat penting, karena sebenarnya atas dasar itulah proses metabolisme berjalan dari waktu ke waktu dan menjadi sasaran kontrol metabolisme. Kontrol tersebut dapat terjadi baik secara alamiah dan buatan dengan menggunakan inhibitor dari luar seperti obat. Untuk membahas hubungan ini lebih rinci, perlu dilihat reaksi umum enzimatik, yaitu:

Pada saat-saat pertama reaksi, laju reaksi pembentukan ES dari E+S tepat sama dengan proses balik dari pembentukan ES dari E+P, oleh karena hanya ada satu kadar ES. Begitu pula, laju penguraian kompleks ES ke arah kiri akan sama dengan arah kanan, oleh karena seluruh sistem berada dalam keadaan seimbang. Dengan demikian, pada saat-saat yang sangat awal tersebut keadaan tadi dinyatakan dalam bentuk persamaan berikut:

Akan tetapi, pada saat-saat yang sangat awal, katakanlah milidetik pertama, nilai [P] sangat kecil dibandingkan dengan [S] dan dapat diabaikan. Dengan demikian, hubungan tersebut dapat dinyatakan sebagai berikut:

k1, k2, dan k3 adalah bilangan-bilangan tetap, sehingga k1/ k2 + k3

juga

mempunyai nilai tetap dan dapat dinyatakan sebagai Km. Oleh karena itu, persamaan tersebut dapat ditulis sebagai berikut:

Pembalikan persamaan ini akan menghasilkan persamaan berikut:

Selanjutnya, jika kadar seluruh enzim atau enzim total dinyatakan sebagai [E]T didefinisikan sebagai jumlah kadar enzim dalam seluruh bentuk yang ada maka [E]T = [E]bebas + [ES], atau [E]T = [E] + [ES]. Dengan sendirinya, [E] = [E]T – [ES]. Jika hal ini disubstitusikan ke persamaan yang terakhir, didapat:

Pada laju reaksi yang maksimum, V semua enzim sudah terikat dalam bentuk kompleks ES. Sedangkan pada tahap yang sangat awal, reaksi berjalan menurut orde pertama, sehingga berbanding lurus dengan jumlah kompleks ES yang baru terbentuk. Oleh karena itu, perbandingan keduanya adalah sebagai berikut:

Hubungan antara kecepatan atau laju awal dengan konsentrasi substrat dapat dicari dengan menata ulang persamaan yang terakhir ini sehingga diperoleh:

Persamaan ini dengan jelas memperlihatkan hubungan antara perubahan kadar substrat dan laju reaksi enzimatik. Persamaan ini terkenal dengan nama Michaelis-Menten dan jika dialurkan dalam grafik, akan diperoleh kurva berupa suatu hiperbola. Nilai Km yang tinggi menunjukkan afinitas terhadap substrat yang rendah. Semakin kecil nilai Km semakin tinggi afinitasnya terhadap substrat, sehingga semakin rendah konsentrasi substrat yang diperlukan untuk mencapai kecepatan reaksi katalitik maksimumnya (Vmaks) (Richana dkk., 2008).

Gambar 1. Kurva Michaelis-Menten

Pada kurva ini, secara garis besar dapat dibedakan dua daerah, yaitu: 1. Daerah yang pertama adalah daerah dengan harga [S] > Km. Nilai Km dapat diabaikan terhadap nilai [S] yang sangat besar, atau Km + [S] ~ [S]. Secara praktis, persamaan Michaelis-Menten akan menjadi,

Jadi, pada konsentrasi substrat yang tinggi, jauh melampaui nilai Km, penambahan konsentrasi substrat tidak lagi menyebabkan kenaikan laju reaksi. Dalam keadaan itu, reaksi berjalan Menurut orde nol. Pada saat itu, seluruh tempat untuk mengikat dan mengolah substrat di molekul enzim sudah diduduki oleh substrat, sehingga substrat yang datang kemudian harus “antri” menunggu giliran untuk diolah enzim yang bekerja dengan kapasitas penuh.

B. INHIBISI

Hambatan atau inhibisi pada suatu reaksi yang menggunakan enzim sebagai katalis dapat terjadi apabila penggabungan substrat pada bagian enzim mengalami hambatan. Molekul atau ion yang dapat menghambat reaksi tersebut dinamakan inhibitor. Inhibitor akan berikatan dengan enzim membentuk kompleks enzim-inhibitor. Hambatan terhadap aktifitas enzim dalam suatu reaksi kimia ini mempunyai arti yang penting, karena hambatan tersebut juga merupakan mekanisme pengaturan-pengaturan reaksi yang terjadi dalam tubuh kita. Sebagian besar obat-obatan bertindak sebagai inhibitor enzim. Contohnya adalah inhibitor yang digunakan sebagai obat aspirin. Aspirin menginhibisi enzim COX-1 dan COX-2 yang memproduksi pembawa pesanperadangan prostaglandin, sehingga ia dapat menekan peradangan dan rasa sakit. Namun,banyak pula inhibitor enzim lainnya yang beracun. Sebagai contohnya, sianida yang merupakan inhibitor enzim ireversibel, akan bergabung dengan tembaga dan besi pada tapak aktif enzim sitokrom c oksidase dan memblok pernafasan sel. Proses inhibisi reaksi enzim ada dua macam : reversible dan ireversibel. Inhibisi ireversibel biasanya berlangsung dalam proses destruksi atau modifikasi suatu gugus fungsi dalam molekul enzim. Inhibisi reversible ditentukan secara kuantitatif dengan menggunakan persamaan-persamaan kinetik MichaelisMenten. Jenis-jenis inihibitor yang diperkenalkan oleh W.W. Cleland, antara lain : (Wirahadikusumah,Muhammad.1989:62)

1. Inhibisi Irreversible (tidak dapat kembali) Hambatan tidak reversible pada umumnya disebabkan oleh terjadinya proses destruksi atau modifikasi sebuah gugus fungsi atau lebih yang terdapat pada molekul enzim. Hambatan ini terjadi karena inhibitor bereaksi tidak reversible dengan bagian tertentu pada enzim, sehingga mengakibatkan berubahnya bentuk enzim. Dengan demikian mengurangi aktivitas katalik enzim tersebut. Sebagai contoh, adalah senyawa diisoprofilfluorofosfat (DFP), yang menghambat enzim

asetilkolinesterase,

yaitu enzim yang penting di dalam

transmisi impuls syaraf. Contoh lainnya adalah efloritina, obat yang digunakan untuk

mengobati

penyakit

yang

disebabkan

oleh

protozoa

African

trypanosomiasis. Penisilin dan Aspirin juga bekerja dengan cara yang sama. Senyawa obat ini terikat pada tapak aktif, dan enzim kemudian mengubah inhibitor menjadi bentuk aktif yang bereaksi secara ireversibel dengan satu atau lebih residu asam amino. Inhibitor ireversibel biasanya memodifikasi kovalen enzim, dan karena itu hambatan tidak dapat dikembalikan. Inhibitor ireversibel sering mengandung kelompok fungsional reaktif seperti mustard nitrogen, aldehida, haloalkanes, alkena, akseptor Michael, sulfonat fenil, atau fluorophosphonates. Penghambatan ireversibel berbeda dari inaktivasi enzim ireversibel. Inhibitor ireversibel umumnya spesifik untuk satu kelas dari enzim dan tidak menonaktifkan semua protein, mereka tidak berfungsi dengan menghancurkan struktur protein tetapi dengan secara khusus mengubah situs aktif dari target mereka. Misalnya, ekstrim pH atau temperatur biasanya menyebabkan denaturasi dari semua struktur protein, tapi ini merupakan efek non-spesifik. 2. Inhibisi reversible Inhibitor reversible mengikat enzim dengan interaksi non-kovalen seperti ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik dan ikatan ion. Pada inhibitor reversible dapat ditentukan secara kuantitatif dengan menggunakan persamaan kinetic michalles- menten. Beberapa obligasi yang lemah antara inhibitor dan situs aktif bergabung untuk menghasilkan kuat dan spesifik mengikat. Berbeda dengan substrat dan inhibitor ireversibel, inhibitor reversibel umumnya tidak mengalami reaksi kimia ketika terikat enzim dan dapat dengan mudah dihilangkan dengan

pengenceran atau dialysis. inhibitor kompetitif: substrat (S) dan inhibitor (I) bersaing untuk situs aktif. Ada dua macam inhibitor reversible enzim menurut pengaruh variasi konsentrasi substrat, yaitu : a. Inhibisi kompetitif

Inhibitor kompetitif memiliki struktur kimia yang mirip dengan substrat dan mengikat enzim pada active site yang sama dengan substrat (tempat katalitik). Maka, inhibitor dan substrat akan bersaing untuk memperebutkan tempat-tempat pengikatan yang sama pada permukaan enzim. Pengaruh inhibitor bersaing ini tidak tergantung pada konsentrasi inhibitor semata tetapi juga pada konsentrasi substrat. Contoh: rekasi inhibisi asam malonat terhadap enzim terhadap enzim suksinat dehidrogenase. Malonat sebagai inhibitor bersaing dan suksinat sebagai substrat terhadap tempat active site (Page,David S.1989). Inhibisi kompetitif disebabkan karena ada molekul mirip dengan substrat, yang dapat pula membentuk kompleks, yaitu kompleks enzim inhibitor (EI) pembentukan kompleks ES, yaitu melalui penggabungan inhibitor dengan enzim pada bagian aktif enzim. Dengan demikian terjadi persaingan antara inhibitor dengan substrat terhadap bagian aktif enzim melalui reaksi sebagai berikut : E + S -------------- ES E + I --------------- EI

Inhibitor ini menghalangi terbentuknya kompleks ES dengan cara membentuk kompleks EI dan tidak dapat membentuk hasil reaksi ( P). E + S -------------- ES ------------ E + P (membentuk hasil reaksi) E + I -------------- EI ------------ ( tidak terbentuk hasil reaksi) Dengan demikian adanya inhibitor bersaing dapat mengurangi peluang bagi terbentuknya kompleks ES dan hal ini menyebabkan berkurangnya kecepatan reaksi. Pengaruh inhibitor bersaing ini tidak tergantung pada konsentrasi inhibitor semata, tetapi juga pada konsentrasi substrat. Pengaruh inhibitor dapat dihilangkan dengan cara menambah sustrat dalam konsentrasi besar. Pada konsentrasi substrat yang sangat besar, peluang terbentuknya kompleks ES juga makin besar. Kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) dapat tercapai pada konsentrasi substrat (s) pada reaksi yang dihambat oleh inhibitor bersaing. Pada inihibisi kompetitif, inhibitor dan substrat berkompetisi untuk berikatan dengan enzim. Seringkali inhibitor kompetitif memiliki struktur yang sangat mirip dengan substrat asli enzim. Sebagai contoh, metotreksat adalah inihibitor kompetitif untuk enzim dihidrofolat reduktase. Kemiripan antara struktur asam folat dengan obat ini ditunjukkan oleh gambar di samping bawah. Perhatikan bahwa pengikatan inhibitor tidaklah perlu terjadi pada tapak pengikatan substrat apabila pengikatan inihibitor mengubah konformasi enzim, sehingga menghalangi pengikatan substrat. Pada inhibisi kompetitif, kelajuan maksimal reaksi tidak berubah, namun memerlukan konsentrasi substrat yang lebih tinggi untuk mencapai kelajuan maksimal tersebut, sehingga meningkatkan Km.

Koenzim asam folat (kiri) dan obat anti kanker metotreksat (kanan) memiliki struktur yang sangat mirip. Oleh sebab itu, metotreksat adalah inhibitor kompetitif bagi enzim yang menggunukan folat.

b. Inhibisi non-kompetitif

Inhibisi non-kompetitif tidak terdapat persaingan antara substrat dan inhibitor. Pada reaksi ini, substrat dan inhibition masing-masing berikatan dengan enzim pada tempat yang berbeda. Inhibitor dapat berikatan baik dengan molekul enzim bebas maupun dengan kompleks ES. Kompleks EIS yang terbentuk kemudian menjadi tidak aktif. Jenis inhibisi ini sangat jarang, namun dapat terjadi pada enzim-enzim multimerik. Inhibitor nonkompetitif yang reversible menurunkan percepatan reaksi maksimal yang diperoleh pada pemberian sejumlah tertentu enzim (Vmaks yang lebih rendah) tetapi biasanya tidak mempengaruhi Km, karena I dan S berikatan pada tempat yang berlainan. Inhibisi non kompetitif adalah hambatan dimana inhibitor bereaksi dengan suatu tempat diluar tempat aktif, sehingga kombinasi substrat dengan enzim tidak dihalangi tetapi pemecahan kompleks enzim substrat di cegah. Dalam hal ini tingkat inhibisi tidak akan bergantung pada substrat tetapi pada konsentrasi inhibitor dan konstanta disosiasi inhibitor. Pada penghambatan nonkompetitif, penghambat berikatan pada sisi enzim selain sisi tempat substrat berikatan, mengubah konformasi molekul enzim, sehingga mengakibatkan inaktifasi dapat balik sisi katalitik. Penghambatan nonkompetitif berikatan secara dapat balik pada kedua molekul enzim bebas dan kompleks ES, membentuk kompleks EI dan ESI yang tidak aktif :

E + I ↔ EI ES + I ↔ ESI (Lehninger. 1982 :251-255). Inhibisi non-kompetitif dapat mengikat enzim pada saat yang sama substrat berikatan dengan enzim. Baik kompleks EI dan ESI tidak aktif. Karena inhibitor tidak dapat dilawan dengan peningkatan konsentrasi substrat, Vmax reaksi berubah. Namun, karena substrat masih dapat mengikat enzim, Km tetaplah sama. c. Persamaan antara inhibitor kompetitif dan non-kompetitif 1) Inhibitor kompetitif dan nonkompetitif adalah dua mekanisme inhibitor enzim. 2) Keduanya adalah jenis mekanisme inhibitor enzim reversibel di mana molekul inhibitor berdisosiasi dari enzim pada titik tertentu. 3) Juga, mereka berdua bertanggung jawab untuk mengurangi aktivitas enzim pada molekul pengikat enzim. 4) Selain itu, mereka memainkan peran kunci dalam pengaturan aktivitas enzim. d. Perbedaan antara inhibitor kompetitif dan non-kompetitif 1) Definisi 

Inhibitor

Kompetitif: Inhibitor

kompetitif mengacu

pada

penyumbatan aksi enzim pada substratnya dengan mengganti substrat dengan senyawa serupa tetapi tidak aktif, yang dapat bergabung dengan situs aktif enzim tetapi tidak ditindaklanjuti atau dipecah oleh enzim. 

Inhibitor Nonkompetitif: Inhibitor nonkompetitif mengacu pada inhibitor enzim di mana senyawa penghambat tidak bersaing dengan substrat alami untuk situs aktif pada enzim tetapi menghambat reaksi dengan menggabungkan dengan kompleks enzim-substrat setelah membentuk kompleks.

2) Konformasi Molekul Penghambat 

Inhibitor

Kompetitif:

Inhibitor

kompetitif

serupa

dalam

konformasi dengan substrat. 

Inhibitor

Nonkompetitif: Inhibitor nonkompetitif memiliki

konformasi yang berbeda dengan substrat. 3) Mengikat ke Situs Aktif 

Inhibitor Kompetitif: Dalam inhibitor kompetitif, molekul bersaing dengan substrat untuk mengikat ke situs aktif enzim.



Inhibitor Nonkompetitif: Dalam inhibitor nonkompetitif, molekul mengikat enzim di situs selain situs aktif enzim.

4) Jenis Ikatan Molekul Penghambat 

Inhibitor

Kompetitif: Inhibitor kompetitif bersaing dengan

substrat untuk pengikatan ke situs aktif enzim. 

Inhibitor Nonkompetitif: Inhibitor nonkompetitif mengikat ke kompleks enzim-substrat.

5) Efek 

Inhibitor Kompetitif: Inhibitor kompetitif memblokir situs aktif enzim.



Inhibitor Nonkompetitif: Inhibitor nonkompetitif bertanggung jawab atas distorsi dalam ukuran atau bentuk situs aktif enzim, yang mengganggu kestabilan kompleks enzim-substrat.

6) Lamanya 

Inhibitor Kompetitif: Inhibitor kompetitif terdisosiasi dari enzim dalam waktu singkat.



Inhibitor Nonkompetitif: Inhibitor nonkompetitif tetap mengikat enzim untuk periode waktu yang cukup lama sampai substrat menjadi tidak tersedia.

7) Efek pada Konsentrasi Substrat



Inhibitor

Kompetitif:

Inhibitor

kompetitif

meningkatkan

konsentrasi substrat. 

Inhibitor Nonkompetitif: Inhibitor nonkompetitif tidak mengubah konsentrasi substrat.

Berikut adalah gambaran mengenai proses dari macam-macam inhibisi enzim :

Pada banyak organisme, inhibitor dapat merupakan bagian dari mekanisme umpan balik. Jika enzim memproduksi terlalu banyak produk, produk tersebut dapat berperan sebagai inhibitor bagi enzim tersebut. Hal ini akan menyebabkan produksi produk melambat atau berhenti. Bentuk umpan balik ini adalah umpan balik negatif. Enzim memiliki bentuk regulasi seperti ini sering kali multimerik dan mempunyai tapak ikat alosterik. Kurva substrat/kelajuan enzim ini tidak berbentuk hiperbolamelainkan berbentuk S. Keuntungan hambatan umpan balik adalah sebagai suatu mekanisme yang cepat dan sensitive untuk menghindari sintetis yang berlabihan daria suatu produk akhir, karena hambatan umpan balik ini hanya akan terjadi jika produk akhir tersebut mulai terakumulasi karena telah melampaui tingkat kebutuhan sel,

kemudian jika senyawa produk akhir ini telah berkurang maka hambatan oleh produk akhir ini juga akan hilang dan enzim dapat aktif kembali.

INHIBISI ION LOGAM Cu2+ TERHADAP KINETIKA ENZIM TRIPSIN Rendy Mardiansyah, Eddy Sulistyowati

A. Metode Penelitian 1. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin

Penentuan aktivitas enzim tripsin dengan substrat kasein dilakukan pada kondisi optimum. Penentuan aktivitas enzim tripsin didasarkan pada metode Anson yang dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan sampel, larutan control dan larutan blangko pada panjang gelombang maksimum yang sebelumnya telah ditentukan. Penentuan aktivitas enzim tripsin terlebih dahulu dilakukan tanpa pengaruh penambahan ion logam Cu 2+ dengan variasi substrat kasein. Adapun variasi konsentrasi substrat kasein yang digunakan berturut-turut adalah 2; 4; 6; 8; dan 10 mg/mL pada setiap tabung reaksi. Prosedur ini masingmasing dilakukan sebanyak tiga kali (triplo) Langkah selanjutnya dilakukan penentuan aktivitas enzim tripsin dengan pengaruh penambahan ion logam Cu2+ dengan variasi konsentrasi substrat kasein yang sama dengan prosedur sebelumnya. Adapun konsentrasi ion logam yang ditambahkan berturut-turut adalah 0,002; 0,004; dan 0,006 M. Prosedur yang dilakukan sama dengan prosedur sebelumnya, hanya pada langkah setelah penambahan enzim tripsin diikuti dengan penambahan ion logam Cu2+ pada larutan sampel dan larutan kontrol, sedangkan pada larutan blanko ion logam Cu2+ sebagai pengganti larutan buffer fosfat. 2. Penentuan parameter kinetika enzim Penentuan parameter kinetika enzim (Vmaks d...