Klonowanie in silico. PDF

Preview

Summary

Wykładowca: dr Sylwia Barańska; dr Ewa Piotrowska (Katedra Biologii Molekularnej). Punkty ECTS: 3. Spis treści: Wektory genetyczne. Wstawki. Enzymy....

Description

Biologia molekularna z biotechnologią Ćwiczenie 1. Klonowanie in silico. Klonowanie molekularne – metoda inżynierii genetycznej wykorzystywana do tworzenia i powielania zrekombinowanych wektorów, niosących wybrany fragment DNA. Polega na łączeniu (rekombinacji) cząsteczki wektora (plazmidu lub faga) z wybranym fragmentem DNA (wstawką) i wprowadzeniu takiego tworu do organizmu w celu amplifikacji hybrydowego DNA z wykorzystaniem aparatu enzymatycznego gospodarza. W efekcie otrzymuje się zbiór cząsteczek identycznych pod względem genetycznym. Narzędzia klonowania: szczepy bakteryjne, wektory, enzymy. Etapy klonowania: 1) Planowanie konstrukcji zrekombinowanego wektora in silico, czyli z wykorzystaniem programów komputerowych; 2) Konstrukcja zrekombinowanych wektorów in vitro, czyli tworzenie zaprojektowanych wektorów z wykorzystaniem technik biologii molekularnej (np. PCR, trawienie restrykcyjne) w warunkach laboratoryjnych; 3) Powielenie skonstruowanych wektorów in vivo, czyli wykorzystanie zdolności wektora do autonomicznej replikacji wewnątrz komórek gospodarza. In silico (łac. „w krzemie”) – prowadzenie eksperymentów z wykorzystaniem komputera. In vitro (łac. „w szkle”) – prowadzenie badań poza organizmem, w probówce. In vivo (łac. „na żywym”) – prowadzenie badań wewnątrz organizmu żywego. Klonowanie – tworzenie identycznych kopii. 1. Wektory genetyczne. Wektor – element genetyczny służący do przenoszenia informacji genetycznej do komórek, mający zdolność do autonomicznej replikacji w organizmie gospodarza. Takimi tworami mogą być plazmidy (najczęściej wykorzystywane są jego pochodne) lub wirusy. Plazmidy – występujące naturalnie w komórkach bakteryjnych cząsteczki DNA. W celu uzyskania wektora plazmidowego, użytecznego w procesie klonowania DNA, plazmidy mogą być zmodyfikowane w następujący sposób: A) masa cząsteczkowa plazmidu zostaje zredukowana – obecność we wnętrzu komórki dużych ilości dodatkowej informacji genetycznej w plazmidowym DNA, spowodowanej rekombinacją z klonowanym fragmentem, wiąże się z pogorszeniem kondycji komórki (fitness) lub spadkiem żywotności. Dlatego: im mniejszy wykorzystywany plazmid, tym większa jego pojemność i można wykorzystywać go do przenoszenia do komórki większych odcinków DNA bez znacznego obniżenia fitness gospodarza. B) geny warunkujące możliwość transferu zrekombinowanego plazmidu do innych bakterii zostają usunięte – dzięki temu przekazywanie wektora odbywać się będzie jedynie wertykalnie (z komórek macierzystych do potomnych). C) utworzenie miejsca wielokrotnego klonowania (ang. multiple cloning site – MCS) – tworzy się poprzez integrację z plazmidem syntetycznego oligonukleotydu zawierającego sekwencje DNA rozpoznawane przez wybrane enzymy restrykcyjne, co ułatwia integrację z wektorem plazmidowym

dowolnego DNA. Spowodowane jest to większym wyborem enzymów restrykcyjnych mogących zostać użytych. D) obecność jednego lub kilku genów markerowych (markerów selekcyjnych) – służą one do wyróżnienia i selekcji transformatorów (komórek, które pobrały zrekombinowany wektor) na podstawie ich fenotypu np. marker selekcyjny odporności na ampicylinę. Rodzaje wektorów: Ø wektory ekspresyjne – warunkują ekspresję wprowadzanych genów lub ich integrację z materiałem genetycznym biorcy; Ø wektory klonujące – zawierają charakterystyczny układ genów, umożliwiający polimerazie DNA rozpoczęcie replikacji; powodują klonowanie, czyli namnażanie w dużych ilościach wprowadzanego materiału genetycznego; Ø wektory bifunkcjinalne (wahadłowe) – mogą egzystować w minimum dwóch różnych organizmach. Przykładem takiego wektora jest plazmid pTEX, który namnaża się zarówno w komórkach bakterii jak i pierwotniaków. Warunkiem przetrwania i powielania wektora jest występowanie w tym wektorze dwóch miejsc rozpoczęcia replikacji, żeby polimerazy DNA obu rodzajów komórek gospodarza mogły odnaleźć swoje preferowane miejsce. Wektory wysokokopije (np. serii pUC) – plazmidy niosące „silne” ori, dzięki czemu występują bardzo licznie w pojedynczej komórce (ok. 15-20). Zwiększanie kopii danego wektora może być stosowane do uzyskania jak największej liczby klonowanego w takim wektorze egzogennego DNA, czy też uzyskania nadprodukcji białka kodowanego przez gen obecny w plazmidzie. Uzyskiwane są z hodowli znajdującej się w późnej fazie logarytmicznej wzrostu.

Wektory niskokopijne (np. pBR322) – plazmidy, gdzie na komórkę gospodarza przypada ich od 3 do 8. Służą do bardziej kontrolowanej inicjacji replikacji, co umożliwia uzyskanie dokładniejszych ilości produktu kodowanego przez dany gen w wektorze. Przed izolacją powinny zostać amplifikowane (proces olbrzymiego zwiększenia ilości).

Przykłady: • wektory plazmidowe – pozachromosomowe fragmenty DNA, głównie cząsteczki koliste; • sztuczne chromosomy – nie zawierają komponentów białkowych, lecz jedynie czysty DNA, który łączy się z białkami jądrowymi; o YAC – sztuczny, liniowy chromosom drożdżowy; o BAC – sztuczny chromosom bakteryjny; • wektory wirusowe (fagowe) – wykorzystują naturalne właściwości wirusów do wbudowywania swojego materiału genetycznego w genom zainfekowanej komórki. Przed

zastosowaniem tego wektora należy pozbawić go infekcyjności, cechuje się małą pojemnością, ale długotrwałą ekspresją; • wektory bakteryjne – naturalne patogeny roślin wyższych, plazmid może na trwałe łączyć się z genomem gospodarza i ulegać ekspresji. 2. Wstawki. Wstawka – fragmenty DNA wybrane do włączenia i powielania w wykorzystywanym plazmidzie. Wstawkę przygotowuje się z użyciem łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. polymerase chain reaction – PCR) co pozwala na jej powielenie (amplifikację). Starter – krótkie oligonukleotydy, komplementarne do matrycowego DNA wstawki, pozwalające poddać ją reakcji PCR. Projektuje się je w taki sposób, aby możliwe było trawienie restrykcyjne amplifikowanych odcinków DNA, a następnie integracja z wektorem plazmidowym: Ø długość startera: 19-25 nt; Ø temperatura topnienia: 58-62°C; Ø oba startery w parze powinny mieć zbliżoną temperaturę topnienia [Tm]; Ø od 40% do 60% par GC; Ø sekwencja startera powinna być pozbawiona powtórzeń (ang. runs) np. „AAAA”; Ø starter nie powinien mieć powtórzeń GC na końcach 5’ i 3’; Ø dobrze, jeśli występuje jeden nukleotyd C lub G na końcach.

3. Enzymy. W procesie klonowania molekularnego często wykorzystuje się różnego rodzaju enzymy: 1) enzymy restrykcyjne – izolowane z bakterii białka o właściwościach endonukleaz, zdolne do rozpoznania specyficznych sekwencji DNA i do przecinania dwuniciowej cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego w odpowiednim miejscu. Powstają tępe lub lepkie końce, co umożliwia zaplanowanie integracji z wektorem plazmidowym; 2) alkaliczna fosfataza – katalizuje reakcję usuwania grup 5’ fosforanowych z kwasów nukleinowych i trifosforanów. Defosforylacja końców DNA podczas przygotowania wektora uniemożliwia jego recyrkularyzację („zamykanie się” pustych, niezawierających wstawki wektorów); 3) fragment Klenowa polimerazy DNA I – posiada aktywność polimerazy (3’ → 5’) i egzonukleolityczną 3’ → 5’, ale bez aktywności egzonukleolitycznej 5’ → 3’, ma zatem zdolność do katalizowania reakcji polimeryzacji bez degradacji końców 5’. W procesie klonowanie enzym ten

wykorzystywany jest do tworzenia tępych końców DNA poprzez wypełnianie lepkich końców (dobudowanie nici DNA do końca 3’ na matrycy końców DNA wysuniętych w kierunku 5’); 4) ligazy DNA – katalizują tworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy dwoma fragmentami DNA. Łączą przerwy w DNA, tak jak ma to miejsce we wszystkich procesach replikacji DNA czy wycinanie i wstawianie ich fragmentów (rekombinacja genetyczna). Replikacja – łączenia fragmentów Okazaki, naprawa DNA. Ligacja – wymagający energii w postaci ATP lub NAD proces łączenia wiązaniem fosfodiestrowym dwóch fragmentów lub końców nici DNA za pomocą ligazy....