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Laboratorio 1: Preparar una solución estándar de albúmina sérica de bovino y determinar su concentración absoluta mediante absorciometría UV. Por: Monserrat Fuentealba López Carrera: Tecnología Médica mención Laboratorio Clínico, Hematología y Banco de Sangre. Resumen. La albúmina de suero bovino es una proteína presente en el suero, sus mejores condiciones de absorbancia se dan entre los 230 y 300 nm. Usando el método de espectrofotometría, el cual consiste en irradiar un haz de luz sobre una muestra y posteriormente cuantificar la absorbancia usando un detector. Se prepararon 25 mL de solución de BSA al 10% p/v y a partir de ella, se preparó una solución a 0,1% p/v. Posteriormente se diluyó en proporción 1:10 y 1:100 cada una de las soluciones, y se midieron en una longitud de onda de 280 nanómetros. Tras anotar los resultados de absorbancia, se procedió a usar una fórmula para determinar concentración de cada tubo. Luego se procedió a analizar los datos y calcular el porcentaje de error. Finalmente se concluye que la mejor forma de realizar la medición es realizando una dilución en la muestra para evitar el exceso de absorbancia.

Introducción. En el experimento que se presentará a continuación, se realizará una medición de albúmina de suero bovino en espectrofotometría. Resumidamente, se podría decir que la albúmina de suero bovino es una proteína de gran tamaño presente en el suero, rica en aminoácidos esenciales y compuestos con puentes disulfuro y grupos tiol (grupos azufrados), pesa 66,430 kDa y tiene un épsilon de 43,824 M −1 cm−1 . Su espectro de absorción es de 230 y 300 nm. Respecto al método que usaremos, será usando una propiedad llamada absorbancia, la cual como menciona la página web La Guía Química (1) consiste en irradiar un haz de luz sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta luz será absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atravesará dicho cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz será transmitida por dicho cuerpo. La absorbancia de una solución es usada con mucha frecuencia en laboratorio clínico, para determinar la concentración de analitos tales como colesterol, glucosa, creatinina y triglicéridos en sangre. La absorbancia es directamente proporcional a la concentración del analito. El objetivo del práctico es determinar la concentración de BSA en varias soluciones a distintas concentraciones, las cuales posteriormente pasarán por un proceso de dilución para poder calcular absorbancia a 280 nanómetros.

Materiales y métodos.           

Espectrofotómetro. Pipetas de vidrio. Micropipetas. Matraces de 25 ml. Tubos Eppendorf 2 ml. Cubeta de cuarzo. Solución de BSA en polvo. Guantes. Agua destilada. Vaso precipitado de 50 ml. Balanza analítica.

Procedimiento: Teniendo el stock concentrado de BSA en polvo, se procede a pesar la cantidad de gramos suficientes para preparar 25 ml de la solución al 10 g/dL (10% p/v), se realiza el siguiente cálculo:

10 % p/v =

x gramos BSA ∗100 25 mL

2,5=x gramos BSA Se procede a pesar los 2,5 gramos de BSA en la balanza analítica, dicha cantidad de albúmina se disuelve cuidadosamente en 20 mL de agua destilada y posteriormente se afora en un matraz a 25 ml, esta solución 1 será la concentrada a 10% p/v. Para preparar 2 ml de la solución a 0,1% p/v se diluirá la solución de 10% p/v, para saber cuántos ml necesitaremos de la solución más concentrada, haremos la siguiente operación:

xml 1∗10 %

p =2 ml2∗0,1% p /v v

xml 1=0,02 ml o 20 ul

Se deben diluir 20 microlitros de la solución concentrada en 1980 microlitros de agua destilada y ya tendremos las dos soluciones a las distintas concentraciones. El siguiente paso es realizar una dilución 1:10 y 1:100 de las dos soluciones, la concentrada y la diluida, cada una de ellas con duplicado para disminuir posibilidad de error. El cálculo para las diluciones sería:

x ul 1 = → 200ul=x ul 10 2000 ul

1:10

Se toman 200 ul de la solución y se completa con 1800 ul de agua destilada. 1:100

x ul 1 = → 20ul=x ul 100 2000 ul Se toman 20 ul de la solución y se completa con 1980 ul de agua destilada.

Una vez hechas las diluciones, se procede a medir en espectrofotómetro a 280 nm y anotar resultados para finalmente determinar concentración molar y relativa de la albúmina, cálculo que se hará a través de la fórmula de concentración 1:

|¿ λ 280 nm| ε (%) ¿ ¿ Concentración

( μgμl )=¿

Se usará también la fórmula de Lambert-Beer para comparar resultados, la fórmula es la siguiente:

Absorbancia=ε∗ [C ]∗l Como se tiene la absorbancia, épsilon y el camino óptico, se procede a despejar la fórmula para poder obtener la concentración, quedando de la siguiente forma: |¿|

ε

=[C ] ¿

Tras realizar la operación, se obtendrá una concentración molar (M), se logrará obtener una concentración en µg/µl mediante las fórmulas de molaridad:

gramos moles moles= Moralidad= litro PM Se obtendrá una concentración en g/l.

Obtenidas las concentraciones, se puede calcular el porcentaje de error estimado, a través de la siguiente fórmula:

obtenido ( Valor esperado−Valor )∗100 Valor esperado Finalmente, se comparan los porcentajes de error.

Resultados. Tras medir en espectrofotómetro, se obtuvieron los siguientes resultados: Absorbancias obtenidas a 280 nm Solución 10% p/v 1 Solución 10% p/v 2 Solución 0,1% p/v 1 Solución 0,1% p/v 2

1:10

1:100

2,500 2,500 0,053 0,058

0,474 0,488 0,008 0,012

Para mejor procesamiento de datos, se procede a realizar un promedio de las mediciones de absorbancia, quedando como resultado final: 1:100 Absorbancias obtenidas a 1:10 280 nm Solución 10% p/v 2,500 0,481 Solución 0,1% p/v 0,055 0,010 Usando los promedios de absorbancia obtenidos, se calcula la concentración teórica de cada tubo mediante la fórmula de concentración 1 y aplicando el factor de dilución para cada caso (1:10 ó 1:100), resultó lo siguiente: *Ejemplo: Reemplazamos valores: Concentraciones teóricas de cada tubo Solución 10% p/v Solución 0,1% p/v

38

((

) )

μg 2,500 = ∗10 ∗10 μl 6,6 %

1:10

1:100

38 µg/µl 0,83 µg/µl

73 µg/µl 1,52 µg/µl

Mediante la fórmula de Lambert-Beer modificada para obtener la concentración, aplicando el factor de dilución correspondiente (1:10 ó 1:100), se usa la absorbancia nuevamente y se obtuvieron los siguientes resultados: *Ejemplo:

=¿ ( 43,8242,500 M cm )

10∗

0,57 M =

−1

−1

0,57 M

gramos moles 0,57 m= 66,430 kDa 1 litro 37,9 g=gramos en 1litro

Reemplazamos valores: Concentraciones obtenidas a partir de la fórmula de Lambert-Beer Solución 10% p/v Solución 0,1% p/v

1:10

1:100

37,9 µg/µl 0,66 µg/µl

72,4 µg/µl 1,53 µg/µl

Con las concentraciones teóricas calculadas podemos usar la fórmula del % de error estimado. Considerando que 10 g/dl están al 10% p/v mediante una regla de proporcionalidad podemos obtener la concentración de la solución al 0,1% p/v, la cual sería 0,1 g/dl, aplicando estos datos a la fórmula, se obtienen los siguientes resultados:

*Ejemplo:

(

100

) )

μg μg −38 μl μl ∗100 =62% μg 100 μl

Reemplazamos valores: % de error estimado Solución 10% p/v Solución 0,1% p/v

1:10

1:100

62% 92%

27% 85%

El menor porcentaje de error es 27% y corresponde al tubo con la solución 10% p/v en dilución 1:100. Discusión. Respecto a los resultados de la medición en espectrofotómetro, se puede observar una mayor cantidad de absorbancia en los tubos de la solución al 10% p/v, lo cual corresponde con la ley de Lambert-Beer cuando dice que, a mayor concentración de la muestra, mayor será la absorbancia obtenida. Pero también nos demuestra que la dilución 1:100 obtuvo una absorbancia más congruente con la ley de Lambert-Beer ya que no sobrepasó los 2,500, cantidad por sobre la cual se supone, hay una pérdida de la linealidad. Según la guía en la que nos basamos para hacer el experimento, la concentración de la solución 10% p/v es 10 g/dl, por lo tanto, se puede inferir que la concentración de la solución 0,1% p/v es de 0,1 g/dl. Tras el procesamiento de los datos, se pudo observar que el tubo con la solución concentrada al 10% p/v y diluida en 1:100, presentó una concentración más cercana a los 10 g/dl (100 µg/µl) correspondiendo ésta a 73 µg/µl; mientras que, en la solución diluida el valor más cercano a 10 µg/µl fue el de la dilución 1:10, valor

que corresponde a 1,52 µg/µl. Esto se vería explicado nuevamente por la ley de Lambert-Beer, que nos dice que cada sustancia absorbe a cierta longitud de onda y dependiendo de su concentración, aumentará o disminuirá su absorbancia, en este caso gracias a los 280 nm del espectrofotómetro, se pudo observar mayor absorbancia en el tubo donde sabíamos, había BSA más concentrada. Por otro lado, observamos que la absorbancia disminuía considerablemente al momento de realizar una dilución, lo cual nuevamente corresponde con la ley, ya que son más partes de agua con una parte de BSA. Respecto al cálculo de error, se puede observar que los valores más bajos son 27% y 85%, valores que corresponden a los tubos que fueron diluidos en 1:100. Conclusiones. Los resultados de la medición en espectrofotómetro nos demostraron que, a mayor concentración del analito mayor será la absorbancia de éste. Queda claramente demostrado que, para obtener mejores resultados, es mejor diluir la muestra ya que así se evitará que el exceso de concentración disminuya demasiado la transmitancia, perjudicando la absorbancia. El cálculo de las concentraciones no estuvo muy cercano a lo real, todos los porcentajes de error fueron superiores a 10%, por lo que se presume que el procedimiento no se realizó de la manera más prolija. Se presume que hubo problemas de pipeteo al momento de preparar las soluciones, ya que el resto del procedimiento no daba lugar a errores cometidos por la persona que está realizando el experimento. Se reafirma el problema con las micropipetas ya que al momento de preparar los 2 mL de cada tubo Eppendorf que iba a ser medido, solía sobrar cerca de 20 µL en la micropipeta. Observando los resultados de cálculo de error, se observa que el porcentaje más bajo es 27%, por eso se presume que dicho tubo fue el que más se acercó a la concentración real del analito. El alto nivel de error se puede disminuir siendo más cuidadosos al momento de preparar los tubos que van a ser medidos, se puede buscar una micropipeta que esté mejor calibrada e incluso hacer más duplicados. Las diluciones muy bajas, no son muy efectivas a la hora de realizar una medición, ya que arrojan absorbancias muy altas, las cuales a su vez, van a resultar en porcentajes de errores demasiado altos. Comparando los resultados de las concentraciones sacadas con la fórmula de concentración 1 y la fórmula

de Lambert-Beer, se puede observar que en el 75% de los casos las concentraciones eran muy similares. Se puede concluir también que las fórmulas están correctamente usadas, y que el alto porcentaje de error se debe a factores de error humano.

Bibliografía: (1): Mónica González. Transmitancia y absorbancia. La Guía Química. Año 2010. Disponible en: https://quimica.laguia2000.com/conceptosbasicos/transmitancia-y-absorbancia. Jerson Sáez Torres. Guía de Laboratorio, Bioquímica Clínica Básica TME-145. Año 2018. Capítulo 1: Preparación una solución estándar de albúmina sérica de bovino y determinación de su concentración absoluta mediante absorciometría UV....