LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI LAUT (BIOINFORMATIKA) PDF

Preview

Summary

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI LAUT Disusun sebagai salah satu syarat untuk mengikuti responsi praktikum mata kuliah Bioteknologi Laut di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Jenderal Soedirman Disusun Oleh : Kelompok 6 Moch. Iqbal Firmansyah L1C015002 Azzam Helmi M L1C016002 Sekar Ajeng...

Description

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI LAUT

Disusun sebagai salah satu syarat untuk mengikuti responsi praktikum mata kuliah Bioteknologi Laut di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Jenderal Soedirman Disusun Oleh : Kelompok 6 Moch. Iqbal Firmansyah Azzam Helmi M Sekar Ajeng W Agus Sistiyana Alfan Amiruzzaman Fransiskus Satria P Vania Dwi Jayanti

L1C015002 L1C016002 L1C016033 L1C016006 L1C016022 L1C016038 L1C016052

Asisten : Okto Oktavianus

L1C0150XX

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO 2019

ACARA 1 BIOINFORMATIKA 1.1.

TINJAUAN PUSTAKA

1.1.1. Bioinformatika Bioinformatika, sesuai dengan asal katanya yaitu “bio” dan “informatika”, adalah gabungan antara ilmu biologi dan ilmu teknik informasi (TI). Pada umumnya, Bioinformatika didefenisikan sebagai aplikasi dari alat komputasi dan analisa untuk menangkap dan menginterpretasikan data-data biologi. Ilmu ini merupakan ilmu baru yang yang merangkap berbagai disiplin ilmu termasuk ilmu komputer, matematika dan fisika, biologi, dan ilmu kedokteran, dimana kesemuanya saling menunjang dan saling bermanfaat satu sama lainnya (Utama, 2003). Bioinformatika meliputi pangkalan data untuk mengelola informasi hayati, penyejajaran sekuens (sequence alignment), prediksi struktur untuk meramalkan struktur protein atau pun struktur sekunder RNA, analisis filogenetik, dan analisis ekspresi gen. Kemampuan untuk memahami dan memanipulasi kode genetik DNA ini sangat didukung oleh TI melalui perangkat perangkat keras maupun lunak. Hal ini bisa dilihat pada upaya Celera Genomics, perusahaan bioteknologi Amerika Serikat yang melakukan pembacaan sekuen genom manusia yang secara maksimal memanfaatkan TI sehingga bisa melakukan pekerjaannya dalam waktu yang singkat (hanya beberapa tahun), dibanding usaha konsorsium lembaga riset publik AS, Eropa, dan lain-lain, yang memakan waktu lebih dari 10 tahun (Deni & Anggorowati, 2018). Setelah informasi terkumpul dalam database, langkah berikutnya adalah menganalisa data. Pencarian 2

database umumnya berdasar hasil alignment/pensejajaran sekuen, baik sekuen DNA maupun protein. Metode ini digunakan berdasar kenyataan bahwa sekuen DNA/protein bisa berbeda sedikit tetapi memiliki fungsi yang sama. 1.1.2. Desain Primer Primer adalah suatu oligonukleotida (biasanya 16 hingga 30 nukleotida) yang dapat digunakan untuk mengawali dalam mengamplifikasi sekuen DNA. Amplifikasi sekuen DNA dengan PCR pada dasarnya menggunakan primer- primer yang berhibridisasi pada utas DNA yang berlawanan. Orientasi arah pemanjangan dari primer mengarah ke dalam melewati daerah sekuen DNA diantara dua primer yang digunakan. Produk DNA yang disintesis dari satu primer berfungsi sebagai DNA template (cetakan) bagi primer yang lain (Aris, 2000). Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer

oligonukleotida

(primer

dipolimerisasimasing-masing

harus

maju

dan

menempel

primer pada

mundur)

sekuens

yang

target,

akan

tepatnya

pada kedua ujungfragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atausetidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerahujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui denganpasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untukmerancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan (Aris, 2000) 1.1.3. Phylogeny

3

Pohon filogenetika atau pohon evolusi adalah diagram percabangan atau “pohon” yang menunjukkan hubungan evolusi antara berbagai spesies makhluk hidup berdasarkan kemiripan dan perbedaan karakteristik fisik dan/atau genetik mereka. Takson yang terhubung pada pohon tersebut berarti diturunkan dari satu nenek moyang bersama. Penggambaran pertama pohon ini antara lain ditemukan

pada buku

Elementary Geology dari Edward Hitchcock (1840) dan The Origin of Species dari Charles Darwin (1859) (Artama, 1991). Untuk mengetahui kekerabatan antara dua spesies atau lebih dapat digunakan program phylogenic tree (pohon filogenik). Pohon filogenetik yang berupa diagram bercabang-cabang ini dapat dikonstruksi berdasarkan kesamaan atau perbedaan sifat fisik atau genetik seperti sekuen DNA, sekuen asam amino (protein), pola pemotongan enzim restriksi, ukuran allel pada analisa microsatellite, dan lain-lain. Program ini digunakan untuk mengetahui jarak kekerabatan, berdasarkan kesamaan nenek moyang dari spesies tersebut. Input yang diberikan dapat berupa sekuens protein atau DNA (Mubarika, 1990). Pohon filogenetika ini dapat diaplikasikan untuk membuat sistematika biologi, seperti pohon kehidupan. Selain itu pohon ini dapat digunakan untuk mencari fungsi dari suatu gen atau protein, riset medis dan epidemiologi seperti HIV, dan studi evolusi. pada Pohon filogenetik dibuat untuk memvisualisasikan hubungan evolusi diantara berbagai spesies atau benda-benda lain. Pohon filogenetik yang berupa diagram bercabang-cabang ini dapat dikonstruksi berdasarkan kesamaan atau perbedaan sifat fisik atau genetik seperti sekuen DNA, sekuen asam amino (protein), pola pemotongan enzim restriksi, ukuran allel pada analisa microsatellite, dan lain-lain. Dalam artikel ini kita akan membuat 4

pohon filogenetik berdasarkan sekuen DNA gen 16S ribosomal RNA dari bakteri-bakteri (Artama, 1991). 1.1.4. Blast Salah satu perangkat lunak pencari database yang paling berhasil dan bisa dikatakan menjadi standar sekarang adalah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Perangkat lunak ini telah diadaptasi untuk melakukan alignment terhadap berbagai sekuen seperti DNA (blastn), protein (blastp), dsb. Baru‐baru versi yang fleksibel untuk dapat beradaptasi dengan database yang lebih variatif telah dikembangkan dan disebut Gapped BLAST serta PSI (Position Specific Iterated)‐BLAST. Sementara itu perangkat lunak yang digunakan untuk melakukan alignment terhadap sekuen terbatas di antaranya yang lazim digunakan adalah CLUSTAL dan CLUSTAL W (Witarto, 2002). Blast (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan perkakas bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. BLAST yang merupakan program pencarian kesamaan yang didisain untuk mengeksplorasi semua database sekuen yang diminta, baik itu berupa DNA atau protein. Program BLAST juga dapat digunakan untuk mendeteksi hubungan di antara sekuen yang hanya berbagi daerah tertentu yang memiliki kesamaan. Penelusuran BLAST (BLAST search) pada basis data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuen (NCBI 5

BLAST Guide). Adapun tingkatan suatu sekuen DNA dapat kita liat melalui beberpa parameter hasil BLAST terdiri atas Bit score, Expect value (E), Identities, dan gaps. Bit score merupakan suatu nialai didalam perhitungan statistikan namun terdapat hasil perbandingan antara data query sequence dan subject sequence. semakin tinggi nilai sequence pada subject sequence yang semakin tinggi nilai similaritas. nilai E yakni jumlah sequence pada subject sequence yang tidk keterkaitan dengan query sequence. semakin nilai e tinggi maka tingkat kepercayaan terhadap kesamaan sekuen tersebut. Identitas merupakan persentase similaritas antara query sequence dan subject sequence. nilai gaps didapat Karena memiliki jumlah kekosongan basa yang dapat muncul dari keseluruhan sekuen yang akan dibandingkan (Deni dan Anggorowati, 2018). BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering digunakan dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan algoritma heuristik dalam penyusunan alignment. Beberapa metode alignmentlain yang merupakan pendahulu BLAST

adalah

metode

"Needleman-Wunsch"

dan

"Smith-Waterman".

Metode

Needleman-Wunsch digunakan untuk menyusun alignment global di antara dua atau lebih sekuens, yaitu alignment atas keseluruhan panjang sekuens tersebut. Metode Smith - Waterman menghasilkan alignment lokal, yaitu alignment atas bagian-bagian dalam sekuens. Kedua metode tersebut menerapkan pemrograman dinamik (dynamic programming) dan hanya efektif untuk alignment dua sekuens (pairwise alignment) (Mount, 2001).

6

1.2.

MATERI DAN METODE

1.2.1. Materi Alat yang digunakan dalam praktikum bioinformatika disajikan dalam Tabel 1. Tabel 1. Alat yang digunakan dalam praktikum No. Alat Kegunaan 1. Laptop Untuk melakukan analisis data 2. Software BIOEDIT Untuk melakukan analisis skuensing 3. Software CLustal Omega Untuk menganalisis kekerabatan DNA 4. Software Phylogeny.fr Untuk membuat pohon phylogeny 5. Jaringan internet Untuk penghubung ke internet Bahan yang digunakan dalam praktikum bioinformatika disajikan dalam Tabel 2. Tabel 2. Bahan yang digunakan dalam praktikum No. Bahan Kegunaan 1. File hasil skuensing Sebagai data yang dianalisis (.seq dan .abl)

7

1.2.2. Metode  Analisis Sekuensing

Data hasil sekuensing dalam format .seq dan.abl dibuka menggunakan program bioedit. Hasil sekuensing dipilih dengan memperhatikan hasil peak kromatogram. Hasil sekuensing yang baik ditandai dengan adanya satu peak untuk setiap nukleotida. Hasil sekuensing yang dipilih dicopy ke ms. word

Buka web : ncbi.nlm.nih.gov dan pilih BLASTn

Salin sekuen pada kolom yang tersedia dan klik BLAST Amati sekuen yang mirip dengan sekuen yang kita analisis dan simpan hasilnya. Analisis hasil BLAST yang meliputi identity (similaritas), coverage, dll. Ambil beberapa sekuen dari hasil BLAST yang mewakili spesies-spesies yang berbeda beda Susun semua sekuen dalam file ms. word

Gunakan semua sekuen tersebut untuk melakukan pensejajaran (multiple sequences aligment) menggunakan program Clustal Omega : Salin semua sekuen pada kolom yang tersedia > Klik submit > Salin hasilnya ke ms. word

Gunakan semua sekuen untuk melakukan analisis filogenetik menggunakan www.phylogeny.fr dengan cara : Klik phyologeny analysis dan pilih “one click” > Salin semua sekuen pada tempat yang tersedia > Klik submit > Salin hasilnya ke ms. word

8



Desain Primer Cari sekuen suatu gen dari bakteri di NCBI

Lakukan analisis BLAST dengan sekuen tersebut unutk memperoleh beberapa sekuen yang mempunyai similaritas tinggi

Salin semua sekuen ke file ms word

Lakukan multiple sequences aligment menggunakan Clustal Omega

Salin dan rapihkan hasilnya pada file ms word

Pilih sekuen dari daerah lestari dan salin ke program primer3. Daerah lestari ditandai dengan tanda bintang (*)

Salin sekuen primer yang diperoleh lengkap dengan melting temperature (Tm)

Analisis sekuen primer tersbeut menggunakan program OlioAnalyzer 3.1 untuk mengetahui peluang terjadinya homodimer. Heterodimer, dan hairpin

catat hasilnya dalam sebuah table.

9

1.3. a.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Bioedit

Gambar 1. Hasil grafik nukleotida dalam software BIOEDIT Dalam Grafik DNA diatas, nilai angka menunjukan nomor nukleotida. Grafik nukleotida yang baik ditunjukan dengan grafik yang memiliki warna sesuai dengan kode nukleotida yang tertera. Biasanya kode nukleotida di akhir dan diawal hasil squensingnya buruk sehingga tidak perlu digunakan. Grafik nukleotida yang baik ditunjukan dengan block hitam.

b.

Hasil analisis Blast Tabel 3. Hasil analisis BLAST Nama spesies

Query cover

E value

Ident

accession

Clarias gariepinus Clarias batrachus Heteropneustes fossilis Pangasianodon hypophthalmus

100% 100% 100% 100%

0.0 0.0 0.0 0.0

99,79% 95,39% 94.13% 93,29%

AF416487.1 AF416485.1 AF147792.1 HM053590.1

Pangasius pangasius

100%

0.0

93,29%

M63713.1

Clarias anguilaris

100%

1e-95

99,51%

HM485573.1

Tachysurus fulvidraco Piaractus mesopotamicus Colossoma macropomum Clarias dussumieri

100% 100% 100% 100%

7e-73 5e-125 2e-131 5e-93

91,13% 81,59% 82,64% 98,52%

KU323395.1 DQ206404.1 KU312263.1 HM485573.1

10

c. Phylogeny Pohon filogenetika atau pohon evolusi adalah diagram percabangan atau “pohon” yang menunjukkan hubungan evolusi antara berbagai spesies makhluk hidup berdasarkan kemiripan dan perbedaan karakteristik fisik dan/atau genetik mereka. Filogenetika diartikan sebagai model untuk merepresentasikan sekitar hubungan nenek moyang organisme, sekuen molekul atau keduanya. Salah satu tujuan dari penyusunan filogenetika adalah untuk mengkonstruksi dengan tepat hubungan antara organisme dan mengestimasi perbedaan yang terjadi dari satu nenek moyang kepada keturunannya.

Gambar 2. Pohon Phylogeny Berdasarkan hasil yang didapat terlihat bahwa pada setiap spesies pada masing – masing pohon phylogeny memiliki tingkat kekerabatan yang dekat. Hal ini dikarenakan nilai sinapomorfiknya mendekati 1.

Karena jika nilai sinapomorfik

mendekati 1 atau sama dengan 1 maka terbentuk hubungan kekerabatan yang nyata. Penggunaan sekuen DNA dalam studi filogenetika adalah bahwa terjadi perubahan basa nukleotida menurut waktu, sehingga akan dapat diperkirakan 11

kecepatan evolusi yang terjadi dan akan dapat direkonstruksi hubungan evolusi antara satu kelompok organisme dengan yang lainnya. Beberapa alasan penggunaan sekuen DNA (Hillis et al. 1996), yaitu (1) DNA merupakan unit dasar informasi yang mengkode organisme, (2) lebih memudahkan dalam mengekstrak dan menggabungkan informasi mengenai proses evolusi suatu kelompok organisme, sehingga mudah untuk dianalisis, (3) memudahkan dalam pembuatan model dari peristiwa evolusi secara komparatif, dan (4) menghasilkan informasi yang banyak dan beragam, dengan demikian akan ada banyak bukti tentang kebenaran suatu hubungan filogenetika (Hidayat dan Pancoro, 2008). d.

Desain Primer Primer adalah oligonukleotida yang penting pada proses PCR (Polymerase Chain

Reaction). Desain primer yang baik merupakan langkah awal dari keberhasilan sekuensing DNA suatu gen. Berdasarkan desain primer yang telah dilakukan, diperoleh hasil desain primer yang ditunjukkan pada gambar dibawah.

Gambar 3. Hasil Desain Primer 12

Primer adalah oligonukleotida yang memiliki peranan penting dalam proses PCR. Untuk mendapatkan primer dapat dilakukan dengan cara melakukan desain primer. Desain primer dapat diperoleh dengan menggunakan bantuan software bioinformatik. Software akan secara otomatis menentukan primer yang layak pada suatu sekuens. Namun tidak semua hasil pemilihan primer secara otomatis sesuai dengan harapan, sehingga diperlukan campur tangan secara manual (Judelson, 2011). Banyak software yang dapat membantu melakukan desain primer secara manual diantaranya yaitu Oligo Analyzer 1.0.2., dan Oligo Explorer 1.1. (Kropinski, 2009). Berdasarkan Gambar 6 dapat dilihat bahwa dalam desain primer tersebut memiliki sequence size 444 dengan product size 323. Pada primer kiri memiliki panjang 20, tm 60.19, gc 50 %, any 6.00, 3’ 3.00 dan segmen primer CTCCTCCGGATTCAACTTCA. Pada primer kanan memiliki Panjang 20, tm 59.97, gc 45%, any 2.00, 3’ 2.00 dan segmen primer CCCAACTCCAGCAAAACAAT. Pada kedua primer memiliki Panjang 20 sehingga dapat dikategorikan kedalam primer yang spesifik.

1.4. Tutorial 1.4.1. Tutorial analisis sekuensing DNA  Buka aplikasi software BioEdit > klik file > open untuk membuka dokumen data hasil skuensing dalam format .seq dan .qbl

13



Setelah terbuka datanya, kemudian buka NCBI pada browser > klik BLAST



Lakukan pemotongan sekuen yang baik dengan cara memblock data sekuen yang bagus dengan melihat grafik nukleotidanya

14



Lalu copy data nukleotida dengan cara klik edit > copy slection



Copy ke Ms. Word kemudian beri nama sekuen nukleotidanya dengan diawali tanda (>)

15



Kembali ke website NCBI > BLAST > copy sekuen nukleotida kedalam kolom “Fasta sequences”



Pada kolom Program Selection ceklis pilihan “somewhat similar sequences” > BLAST

16



Kemudian akan muncul seperti pada tampilan dibawah ini (block merah menunjukan =>200 nukleotida, ungu = 80-200, hijau 50-80, biru= 40-50 dan hitam PASTA > copy nukleotidanya



Kemudian rapihkan data dengan menyisakan nama dan kode accesnya tanpa menggunakan spasi

18



Setelah itu untuk mensejajarkan 2 DNA atau lebih buka website Clustal Omega > pilih DNA karena kita menggunakan data DNA



Lalu copy seluruh data sekuen DNA pada clustad omega > klik submit

19



Setelah proses submit selesai maka akan muncul data data dari sekuen DNA yang memiliki kemiripan dari 10 spesies. Perhatikan daerah lestari pada tiap baris DNA yang ditandai dengan tanda bintang (*). Daerah lestari menunjukan bahwa spesies tersebut dari baris 1-10 sama DNA nya. Sedangkan tanda strip (- - - ) menunjukan gen pengkode tersebut lebih pendek .



Buka website phylogeny.fr > One Click > copy data sekuen DNA> klik submit> salin hasil ke Ms. Word 20



Simpan hasil dalam bentuk PDF

21

DAFTAR PUSTAKA Aris T W. 2000. Inverse Polymerase Chain Reaction. Jurnal Hayati. Vol 7 (4) : 121-123 Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM. Yogyakarta Deni, E.N. dan Anggorowati, D.R. 2018. Pengantar Bioteknologi (Teori dan Aplikasi). Deepublish. Yogyakarta. Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM. Yogyakarta Mount, D.W. (2001), Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-608-7 Utama. A. 2003. Peranan Bioinformatika dalam Dunia Kedokteran. http://www.komputasi.lipi.go.id/data/1014224403/data/1110939555.pdf. Diakses tanggal 27 Juni 2019. Witarto, A.B. 2003. Bioinformatika Menawinkan Teknologi Informasi dengan Bioteknologi. Ilmu Komputer. Jakarta.

22

ACARA II. ISOLASI DNA 2.1. Tujuan 1.

Mahasiswa dapat mengetahui metode isolasi DNA

2.

Mahasiswa dapat mengetahui cara mengukur konsentrasi dan menentukan kemurnian DNA

2.2. Tinjauan Pustaka 2.2.1. Pengertian DNA dan Sifat-Sifat DNA DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) adalah bahan genetik yang memberi informasi dari sel ke sel dan dari generasi ke generasi. DNA terdiri dari dua utas benang polinukleotida yang saling berpilin (double helix atau berpilih ganda) yang tersusun atas gugusan gula deoksiribosa , gugusan asam fosfat, dan gugusan basa (Sitompul, 2015). Brookes (2005) menyatakan bahwa DNA merupakan materi genetik dari sebagian besar organisme. Tiap kromosom adalah suatu molekul DNA yang sangat panjang. Molekul kimia penyusun DNA dinamakan nukleotida. Satu nukleotida terdiri dari satu molekul gua dan satu molekul fosfat yang terkait pada salah satu basa DNA, yaitu Timin, Adenin, Guanin, dan Sitosinin. Cambell et al. (2002) menyatakan bahwa, sifat-sifat dari DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) antara lain meliputi: a.

DNA sebagai materi genetik (usaha pencarian materi genetik mengarah pada

DNA: sains sebagai proses);

...