Laporan Praktikum Farmakokinetik Validasi Metode Analisis Penentuan Kurva Kalibrasi, LOD dan LOQ Dengan Spektrofotometri PDF

Preview

Summary

LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOKINETIK MODUL 1 PENGEMBANGAN METODE ANALISIS OBAT DALAM SAMPEL BIOLOGIS Validasi Metode Analisis Penentuan Kurva Kalibrasi Dengan Spektrofotometri A. TUJUAN Melakukan validasi metode analisis sampel dengan penentuan kalibrasi dengan spektrofotometri untuk memastikan bahwa me...

Description

Accelerat ing t he world's research.

Laporan Praktikum Farmakokinetik Validasi Metode Analisis Penentuan Kurva Kalibrasi, LOD dan LOQ Dengan Spektrof... Emil Nur Arifah

Related papers

Download a PDF Pack of t he best relat ed papers 

Laporan Akhir Prakt ikum LAPORAN PRAKT IKUM VALIDASI MET ODE PARAMET ER LOD DAN LO… kusuma dewi SKRIPSI Diajukan sebagai salah sat u syarat unt uk memperoleh gelar Sarjana Sains Byut a Aj LAPORAN FIX KEL 7 GOL 1 NA diklofenak Puput rhamadaniharfa Harfa

LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOKINETIK MODUL 1 PENGEMBANGAN METODE ANALISIS OBAT DALAM SAMPEL BIOLOGIS Validasi Metode Analisis Penentuan Kurva Kalibrasi Dengan Spektrofotometri A. TUJUAN Melakukan validasi metode analisis sampel dengan penentuan kalibrasi dengan spektrofotometri untuk memastikan bahwa metode yang digunakan sidaj sesiao dengan tujuan penggunaan dan memberikan hasil yang dapat dipercaya. B. PRINSIP Validasi metode analisis sampel Paracetamol menggunakan Spektrofotometri dengan parameter linieritas, Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ). C. DASAR TEORI Tahap awal dalam penelitian farmakokinetik adalah penentuan kadar obat dalam sampel biologis, karena parameter farmakokinetik obat tersebut diperoleh berdasarkan hasil pengukuran kadar obat utuh dan atau hasil uraian (metabolitik) dalam sampel biologis seperti darah, urine, saliva, dan lain-lain. Metode analisis yang digunakan untuk menentukan kuantitatif kadar obat dalam sampel biologis merupakan hal yang sangat penting dalam evaluasi dan intepretasi data farmakokinetik. Oleh karena itu metode analisis yang tervalidasi merupakan suatu kebutuhan mutlak untuk memperoleh hasil yang dapat dipercaya. Tahap untuk mendapatkan metode analisis yang valid untuk diaplikasikan dalam suatu penelitian farmakokinetik meliputi pengembangan metode analisis dan validasi metode analisis yang digunakan. Dalam tahap pengembangan perlu diperhatikan apakah untuk obat yang akan diteliti belum pernah ada metode analisis untuk penentuan kadar obat tersebut dalam matriks biologis yang akan digunakan. Jika memang belum ada metode analisis yang telah dikembangkan, maka perlu diperhatikan struktur dan sifat fisikokimia obat yang akan diteliti. Apakah ada metode analisis untuk metode lain dengan struktur yang mirip dengan matriks biologis yang sama. Jika ada, data ini merupakan suatu awal untuk memulai suatu pengembangan metode analisis. Dalam banyak kasus, metode analisis untuk penelitian farmakokinetik dapat diadaptasi dari suatu atau beberapa metode analisis yang telah dipublikasikan dengan melakukan sedikit ataupun berbagai modifikasi untuk mendapatkan hasil yang diinginkan. Metode analisis yang umum digunakan dalam penelitian farmakokinetik adalah

1. Metode kimia, contohnya : HPLC (High Performance Liquid Chromatography), GC

(Gas

Chromatography),

LC-MS

(Liquid

Chromatography

Mass

Spectrophotometry). 2. Metode

bilogis,

yang

didasarkan

pada

prosedur

immunoassay

(RIA,

radioimmunoassay), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dan metode mikrobiologi. Pengembangan metode analisis meliputi evaluasi dan optimasi berbagai tahapan, seperti penyiapan sampel, pemisahan analit atau obat yang diteliti, deteksi dan kuantifikasi. Validasi suatu metode anlisis dilakukan untuk menjamin bahwa metode yang akan digunakan adalah valid dan terpercaya. Beberapa parameter digunakan untuk mengevaluasi validitas dan metode yang dikembangkan, antara lain: perolehan kembali (recovery) obat dari matriks biologi yang digunakan, presisi dan akurasi. Persyartan yang dituntut bagi suatu metode tersebut dapat memberikan nilai perolehan kembali yang tinggi (75-90% atau lebih), kesalahan acak dan kesalahan sistemik kurang dari (10%). Kepekaan dan selektivitas peralatan merupakan kriteria lain yang penting, hal mana nilainya akan sangat tergantung dari alat pengukur yang digunakan. Stabilitas obat akan diteliti dalam matriks sampel juga harus diperhatikan. Berbagai sampel biologis dapat diambil untuk penentuan kadar obat dalam tubuh untuk penelitian farmakokinetik, sebagai contoh : darah, urin, feses, saliva, jaringan tubuh, cairan blister, cairan spinal, dan cairan sinovial. Darah merupkan sampel biologis yang paling umum digunakan dan mengandung berbagai protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya bukan darah utuh (whole blood) tetapi plasma ataupun serum yang digunakan untuk penentuan kadar obat. Serum diperoleh dengan membiarkan darah untuk menggumpal dan supernatan yang dikumpulkan setelah sentrifugasi adalah serum. Sedangkan plasma diperoleh dengan penambahan antokoagulan pada darah yang diambil dan supernatan yang diperoleh setelah sentrifugasi merupakan plasma. Jadi plasma dan serum dibedakan dari protein yang dikandungnya. Adanya kandungan protein dalam sampel biologis yang akan dianalisamenyebabkan dibutuhksnnys suatu tahap perlakuan awal dan atau penyiapan sampel sebelum penentuan kadar obat dapat dilakukan. Hal ini untuk mengisolasi atau memisahkan obat akan diteliti dari matriks sampel yang diperoleh. Protein, lemak, garam, dan senyawa endogen dalam sampel akan mengganggu penetuan kadar obat yang bersangkutan dan

selain itu dalam hal analisa menggunakan metode seperti HPLC adanya zat-zat tersebut dapat merusak kolom HPLC sehingga usia kolom menjadi lebih singkat. Berbagai prosedur untuk mendenaturasi protein dapat digunakan sebagai perlakuan awal sampel biologis yang diperoleh dari suatu penelitian farmakokinetik, meliputi penggunaan senyawa yang disebut sebagai zat pengendap protein (protein precipitating agent) sepeti, asaam tungstat, ammonium sulfat, asam trikloroasetat (trichoroacetic acid, TCA) , asam perkolat, metanol, dan asetonitril. Penggunaan pelarut organik seperti metanol dan asetonitril sebgai zat pengendap protein sangat umum digunakan terutama yang melibatkan metode analisis HPLC. Penggunaan metanol dan asetonitril mempunyai suatu keuntungan karena kompatibilitasnya dengan berbagai eluen yang digunakan dalam metode HPLC. Metode isolasi atau pemisahan obat yang banyak digunakan dalam penelitian farmakokinetik adalah ekstrasi padat-cair (solid-phase extraction) dan ekstraksi cair-cair. Ekstraksi padat-cair menggunakan catridge khusus untuk memisahkan obat dan sampel dengan volume yang relatif kecil (0,1-1 ml) yang tersedia secara komersial dengan harga yang cukup mahal. Ekstraksi cair-cair merupakan suatu metode yang paling banyak digunakan karena relatif cepat, simple, dan murah dibandingkan dengan ekstraksi padatcair pada umumnya diikuti dengan proses pemekatan obat yang akan dianalisa. Pemilihan pelarut pengekstraksi dalam ekstraksi cair-cair harus didasarkan pada sifat fisikokimia obat maupun metabolit yang akan diisolasi. Berbagai faktor dapat menjadi pertimbangan dalam seleksi pelarut yang akan digunakan, antara lain: 1. Immisible (tidak bercampur) dengan air 2. Mempanyai kemampuan melarutkan obat yang dinginkan dalam jumlah yang besar sehingga memberikan nilai recovery yang besar 3. Mempunyai titik didih yang relatif rendah sehingga waktu evaporasi pelarut dapat lebih singkat 4. Sedapat mungkin volume yang digunakan untuk ekstraksi adalah minimal sehingga akan menekan biaya yang dikeluarkan 5. Jika memungkinkan gunakan pelarut dengan berat jenis yang lebih kecil dan berat jenis air schingga proses pemisahan pelarut organik akan lebih mudah karena pelarut organik akan berada pada lapisan atas. Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang

menghubungkan antara respon (Y) dengan konsentrasi (X). Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (Slope), intersep, dan koefisien korelasinya (Gandjar dan Rohman, 2007). Linieritas juga dapat dilakukan dengan mengukuran absorbansi larutan pembanding, kemudian dibuat kurva hubungan antara kadar vs serapan dan ditentukan persamaan regresi linier serta koefesien korelasi (x) dan koefesien korelasi dari fungsi (Vxo). Koefesien fungsi regresi dapat dihitung menggunakan rumus dibawah ini (Harmita, 2004): ∑

Sy/x = √

–

Keterangan : Sy/x

: Simpangan Baku residual

Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Definisi batas deteksi yang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blanko (yb) ditambah dengan 3 simpangan baku blanko (3Sb). Limit Of Detection seringkali diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada rasionya 2 atau 3 dibanding 1. ICH mengenalkan suatu konvensi metode signal to noise ratio ini, meskipun demikian ICH juga menggunakan 2 metode pilihan lain untuk menentukan LOD yakni metode non instrumental visual dan dengan metode perhitungan. Metode non instrumental visual digunakan pada teknik kromatografi lapis tipis dan pada metode titrimetri. LOD juga dapat dihitung berdasarkan pada

standar deviasi (SD)

respon dan kemiringan (Slope,S) kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai dengna rumus, LOD = 3,3 (SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada SD blanko, pada SD residual dari garis regresi atau standar deviasi intersep y pada garis regresi (Gandjar dan Rohman, 2007). Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. LOQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi (dengan akurasi dan presisi juga dilaporkan). Kadang-kadang rasio signal tunoise 10:1 digunakan untuk menentukan LOQ. Perhitungan LOQ dengan rasio signal to noise 10:1

merupakan aturan umum, namun LOQ merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi yang dipersyaratkan. Sehingga konsentrasi LOQ menurun maka presisi juga menurun. Jika presisi tinggi dipersyaratkan, maka konsentrasi LOQ yang lebih tinggi harus dilaporkan. ICH mengenalkan metode rasio signal to noise ini, namun sebagai mana dalam perhitungan LOD, ICH juga menggunakan 2 metode untuk menentukan LOQ yaitu metode non instrumental visual dan metode perhitungan. Metode perhitungan didasarkan pada standar deviasi respon (SD) dan slope (S) kurva baku sesuai dengan rumus: LOQ = 10 (SD/S) standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan standar deviasi blanko pada standar deviasi residual garis rekresi linier atau dengan standar deviasi intersep-y pada garis regresi (Gandjar dan Rohman, 2007). D. TUGAS PENDAHULUAN 1. Tuliskan pembuatan dapar phospat pH 7,4 dan perhitungannya! Jawab : Dibuat dengan mencampur 50mL KH2PO4 0,2 M dengan sejumlah 39,1mL NaOH 0,2N dan diencerkan dengan air bebas karbondioksida P secukupnya hingga 200mL (Source: FI edisi III hal 755). Pembuatan dapar phospat pH 7,4 sebanyak 2 L KH2PO4

=

KH2PO4

=

0,2 M

=

Gram KH2PO4

=

Gram KH2PO4

=

NaOH

=

NaOH

=

0,2 N

=

Gram NaOH

=

13,608 gram

Gram NaOH

=

3,128 gram

Jadi pembuatan dapar phospat pH 7,4 sebanyak 2 L dibuat dengan menimbang KH2PO4 sebanyak 13,608 gram kemudian dilarutkan dalam 500mL air bebas karbondioksida, menimbang NaOH sebanyak 3,128 gram kemudian dilarutkan dalam 391 mL air bebas karbon dioksida. Campurkan kedua larutan dan tambahkan air bebas karbondioksia secukupnya hingga 2L. 2. Jelaskan perhitungan dan pembuatan larutan induk Paracetamol 1000 bpj sebanyak 100mL! Jawab : Paracetamol 1000 bpj

= 1000 μg / mL

Pembuatan untuk volume 100 mL Paracetamol 1000 bpj

= 100.000 μg /100 mL = 100 mg / 100 mL

Jadi penimbangan paracetamol untuk pembuatan larutan induk paracetamol 1000 bpj sebanyak 100mL adalah 100mg, kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai secukupnya hingga 100mL 3. Jelaskan perhitungan 1 seri set pengenceran larutan induk konsentrasi 2,4,6,10, 12 ppm sebanyak 50mL! Jawab : Pengenceran Paracetamol induk 1000 bpj menjadi 100 bpj sebanyak 100mL V1 . C1

= V2 . C2

V1 . 1000 bpj

= 100mL . 100 bpj

V1

= 10 mL

Pengenceran paracetamol 100 bpj menjadi beberapa seri konsentrasi : Pengenceran konsentrasi 2 bpj V1 . C1

= V2 . C2

V1 . 100 bpj

= 50mL . 2 bpj

V1

= 1 mL

Pengenceran knsentrasi 4 bpj V1 . C1

= V2 . C2

V1 . 100 bpj

= 50mL . 4 bpj

V1

= 2 mL

Pengenceran konsentrasi 6 bpj V1 . C1

= V2 . C2

V1 . 100 bpj

= 50mL . 6 bpj

V1

= 3 mL

Pengenceran konsentrasi 10 bpj V1 . C1

= V2 . C2

V1 . 100 bpj

= 50mL . 10 bpj

V1

= 5 mL

Pengenceran konsentrasi 12 bpj V1 . C1

= V2 . C2

V1 . 100 bpj

= 50ml . 12 bpj

V1

= 6 ml

E. ALAT & BAHAN Alat

1. Mikropipet 2. Spektrofotometri UV-Vis 3. Kuvet 4. Beaker glass 5. Pengaduk kaca

Bahan

1. Paracetamol 2. NaOH 3. KH2PO4 4. Aquadest 5. HCl 6. NaNO3 7. Asam amidosulfonat

F. PROSEDUR KERJA 1. Pembuatan larutan baku dapar phospat pH 7,4

Kalibrasi wadah 2L

Timbang 13,608 gram KH2PO4

Larutkan dengan aquades hingga volume 500mL (A)

Campurkan larutan A dan B, tambahkan aquadest sebelum tanda batas

Larutkan dengan aquades hingga volume 391mL (B)

Timbang 3,128 gram NaOH

Ukur pH hingga pH ± 7,4

Tambahkan aquades hingga tanda batas.

2. Pembuatan pereaksi warna

Tambahkan 0,5mL HCL 6N

Tambahkan 1 mL NaNO3 10%

Vortex selama 1 menit, lalu diamkan selama 5 menit

Diamkan 3 menit didalam es

Tambahkan 2,5 mL NaOH 10%

Tambahkan 1mL asam amidosulfonat 15%

3. Pembuatan kurva kalibrasi Paracetamol 1 Lakukan pengenceran PCT 100 bpj dalam 100mL

Encerka PCT 100 bpj menjadi beberapa seri konsentrasi

Tambahkan masing-masing dapar posphat pH 7,4 10mL

Membuat larutan 2, 4, 6, 10, dan 12 bpj sebanyak 50mL

Membuat larutan induk PCT 1000bpj sebanyak 100 mL

Aduk masingmasing larutan hingga homogen

Ukur absorbansi larutan tersebut menggunakan spektrofotmetri UV dengan λ 243nm 4. Pembuatan kurva kalibrasi Paracetamol 2 Membuat larutan induk PCT 1000bpj sebanyak 100 mL

Encerka PCT 1000 bpj menjadi beberapa seri konsentrasi

Membuat larutan 20, 40, 60, 100, dan 120 bpj sebanyak 10mL

Aduk masingmasing larutan hingga homogen

Tambahkan pereaksi warna

Tambahkan masing-masing dapar posphat pH 7,4 10mL

Ukur absorbansi larutan tersebut menggunakan spektrofotmetri Vis dengan λ 435nm

G. DATA PENGAMATAN 1. Paracetamol 243 nm

Kurva Baku PCT 243 nm 0.8 0.7

y = 0.0603x - 0.0115 R² = 0.9845

Absorbansi

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

2

4

6

8

10

12

14

Konsentrasi (ppm)

Gambar 1. Kurva baku Paracetamol 1 pada panjang gelombang 243nm Tabel 1. Nilai LOD dan LOQ pada Paracetamol 1 Konsentrasi (bpj)(x) Blanko (0) 2 4 6 8 10 12

absorbansi (y) (0) 0.098 0.255 0.323 0.506 0.558 0.724

y’

y−y′

|y-y'|2

0.1091 0.2297 0.3503 0.4709 0.5915 0.7121

-0.0111 0.0253 -0.0273 0.0351 -0.0335 0.0119 ∑ SD LOD LOQ

0.0001 0.0006 0.0007 0.0012 0.0011 0.0001 0.0040 0.0283 1.4080 4.6932

Perhitungan : Persamaan regresi linier : y = 0.0603x - 0.0115 Konsentrasi 2 ppm y’

y-y’ (y-y’)2

=

0.0603x - 0.0115

=

(0.0603 . 2) – 0.0115

=

0.1091

=

0.098 – 0.1091

=

-0.0111

=

(-0.0111)2

=

0.0001

√

∑

SD

=

SD

=

√

SD

=

SD

=

√

SD

=

LOD

=

LOD

=

LOD

=

LOQ

=

LOQ

=

LOQ

=

√

0.0283

1.4080

4.6932

2. Paracetamol 435 nm

Kurva Baku PCT 435nm 0.5 0.45

y = 0.0039x - 0.0164 R² = 0.9931

0.4 Absorbansi

0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0

20

40

60

80

100

120

140

Konsentrasi (ppm)

Gambar 2. Kurva baku Paracetamol 2 pada panjang gelombang 435nm Tabel 1. Nilai LOD dan LOQ pada Paracetamol 2 Konsentrasi (bpj) (x) Blanko (0) 20 40 60 80 100 120

Absorban (y) 0 0.057 0.135 0.225 0.311 0.391 0.438

y’

y−y′

|y-y'|2

0.0616 0.1396 0.2176 0.2956 0.3736 0.4516

-0.0046 -0.0046 0.0074 0.0154 0.0174 -0.0136 ∑ SD LOD LOQ

0.0000212 0.0000212 0.0000548 0.0002372 0.0003028 0.0001850 0.0008220 0.0128215 9.8627264 32.8757548

Perhitungan : Persamaan regresi linier : y = 0.0039x - 0.0164 Konsentrasi 20 ppm y’

=

0.0039x - 0.0164

=

(0.0039 . 20) – 0.0164

=

0.0616

=

0.057 - 0.0616

=

-0.0046

=

(-0.0046)2

=

0.0000212

SD

=

√

SD

=

√

SD

=

√

y-y’ (y-y’)2

SD

=

SD

=

LOD

=

LOD

=

LOD

=

LOQ

=

LOQ

=

LOQ

=

∑

√

0.01282

9.8627

32.8757

H. PEMBAHASAN Pada praktikum kali ini dilakukan validasi metode analisis Paracetamol dengan parameter linieritas atau rentang, Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ) menggunakan Spektrofotometri UV-Vis. Validasi merupakan konfirmasi melaluui bukti pemeriksaan dan telah sesuai dengan tujuan pengujian. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis sesuai untuk peruntukannya. Perlunya dilakukan validasi metode analisis karena elemen penting dari control kualitas, validasi membantu memberikan jaminan bahwa pengukuran dapat diandalkan. Validasi metode analisis dilakukan dengan penentuan kadar paracetamol secara Spektrofotometri UV-Vis. Analisis paracetamol menggunakan spektrofotometri karena senyawa paracetamol merupakan senyawa organic yang memiliki gugus kromofor yang menyebabkan serapan elektron dan gugus auksokrom yang terikat pada gugus kromofor yang akan mempengaruhi panjang gelombang dan intensitas serapan maksimalnya. Percobaan dilakukan dengan membuat larutan induk paracetamol 1000 ppm seban...